中華人民共和國國家標(biāo)準

GB5009.240—2016

食品安全國家標(biāo)準

食品中伏馬毒素的測定

2016-08-31發(fā)布2016-09-20實施

中華人民共和國

國家衛(wèi)生和計劃生育委員會

發(fā)布

GB5009.240—2016

Ⅰ

前言

本標(biāo)準代替GB/T25228—2010《糧油檢驗玉米及其制品中伏馬毒素含量測定免疫親和柱凈

化高效液相色譜法和熒光光度法》、

SN/T1958—2007《進出口食品中伏馬毒素B1殘留量檢測方法酶

聯(lián)免疫吸附法》、

SN/T1572—2005《進出口糧谷中伏馬毒素檢驗方法高效液相色譜法》。

本標(biāo)準將以上標(biāo)準進行了整合,主要修訂如下:

———標(biāo)準名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準食品中伏馬毒素的測定”;

———伏馬毒素種類增加為伏馬毒素B

1、B2、B3三種;

———增加了免疫親和柱凈化-柱后衍生液相色譜法作為第一法;

———增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為第二法;

———取消熒光光度法;

———改變了樣品提取溶液;

———改變了免疫親和柱凈化-柱前衍生高效液相色譜法流動相的組成。

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1

食品安全國家標(biāo)準

食品中伏馬毒素的測定

1范圍

本標(biāo)準規(guī)定了玉米及其制品中伏馬毒素B

1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3(以下簡寫為FB1、FB2、FB3)

的測定方法。

本標(biāo)準第一法為柱后衍生液相色譜法,第二法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法,第三法為柱前衍生液

相色譜法,適用于玉米及其制品中伏馬毒素的測定。

第一法免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法

2原理

樣品用乙腈-水溶液提取,經(jīng)稀釋后過免疫親和柱凈化,去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干

擾物質(zhì)。經(jīng)高效液相色譜分離后柱后鄰苯二甲醛衍生,熒光檢測,外標(biāo)法定量。

3試劑和材料

除非另有說明,本方法使用的試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

3.1試劑

3.1.1甲醇(CH3OH):色譜純。

3.1.2乙腈(CH3CN):色譜純。

3.1.3乙酸(CH3COOH)。

3.1.4氫氧化鈉(NaOH)。

3.1.5氯化鈉(NaCl)。

3.1.6磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。

3.1.7磷酸二氫鉀(KH2PO4)。

3.1.8氯化鉀(KCl)。

3.1.9硼砂(Na2B4O7·10H2O)。

3.1.102-巰基乙醇(C2H6OS)。

3.1.11鄰苯二甲醛(OPA,C8H6O2)。

3.1.12吐溫-20(C58H114O26)。

3.2溶液配制

3.2.1甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,加入到999mL水中,混合均勻。

3.2.2乙腈-水溶液(50+50):分別量取500mL乙腈和500mL水,混合均勻。

3.2.3乙腈-水溶液(20+80):分別量取200mL乙腈和800mL水,混合均勻。

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2

3.2.4甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均勻。

3.2.5氫氧化鈉溶液(1mol

/L):準確稱取氫氧化鈉4.

0g,溶于100mL

水,混合均勻。

3.2.6磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀,用

980mL水溶解,用鹽酸調(diào)整

pH

至7.

4,用水稀釋至1000mL,混合均勻。

3.2.7吐溫-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐溫-20,加入磷酸鹽緩沖液(3.2.6)并稀釋至1000mL,

混合均勻。

3.2.8硼砂溶液(0.05mol

/L,

pH10.5):稱取硼砂19.

1g,溶于980mL水中,用氫氧化鈉溶液調(diào)

pH

至

10.5,用水稀釋至1000mL,混合均勻。

3.2.9衍生溶液:稱取2.0g鄰苯二甲醛,溶于20mL甲醇中,用硼砂溶液(0.05mol

/L,

pH10.5)(3.2.8

)稀

釋至500mL,加入2-巰基乙醇500μL,混勻,裝入棕色瓶中,現(xiàn)用現(xiàn)配。

3.3標(biāo)準品

3.3.1伏馬毒素B1(FB1,C34H59NO15),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

3.3.2伏馬毒素B2(FB2,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

3.3.3伏馬毒素B3(FB3,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

3.4標(biāo)準溶液配制

3.4.1標(biāo)準儲備溶液(0.1mg/mL):分別準確稱取FB1、FB2、FB3各0.01g(精確至0.0001g)至小燒杯

中,用乙腈-水溶液(3.

2.2)溶解,并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保

存。有效期6個月。

3.4.2混合標(biāo)準溶液:準確吸取FB1標(biāo)準儲備液1mL、FB2和FB3標(biāo)準儲備液0.5mL至同一10mL

容量瓶中,加乙腈-水溶液(3.

2.2)稀釋至刻度,得到FB1濃度為10μg/mL、FB2和FB3濃度為5μg/mL

的混合標(biāo)準溶液。再稀釋10倍,得到FB

1濃度為1μg

/mL、

FB2和FB3濃度為0.5μg/mL的混合標(biāo)準

溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6個月。

3.4.3混合標(biāo)準工作溶液:準確吸取混合標(biāo)準溶液,用乙腈-水溶液(3.2.3)稀釋,配制成FB1濃度依次

為20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB

2和FB3濃度依次為

10ng

/mL、

40ng

/mL、

80ng

/mL、

120ng

/mL、

160ng

/mL、

200ng

/mL的系列混合標(biāo)準工作溶液。

4儀器和設(shè)備

4.1高效液相色譜儀,帶熒光檢測器。

4.2柱后衍生系統(tǒng)。

4.3天平:感量0.01g和0.0001g。

4.4均質(zhì)器。

4.5振蕩器。

4.6氮吹儀。

4.7離心機:轉(zhuǎn)速≥4000r/min。

4.8免疫親和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)(柱容量及柱回收率驗證方法參見附錄B)。

注:對于每個批次的親和柱在使用前需進行質(zhì)量檢驗。

4.9微孔濾膜:0.45μm,有機型。

5分析步驟

5.1樣品制備

將固體樣品按四分法縮分至1kg,全部用谷物粉碎機磨碎并細至粒度小于1mm,混勻分成2份作

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3

為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封,標(biāo)識后置于4℃下避光保存。

玉米油樣品直接取2份作為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封,標(biāo)識后置于4℃下避光保存。

在制樣的操作過程中,應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

5.2試樣提取

準確稱取固體樣品5g(精確至0.

01g)樣品于50mL離心管中,加入20mL乙腈

-水溶液(3.2.2),

渦旋或振蕩提取20min,取出后,在4000r/min下離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。

玉米油樣品操作同固體樣品,提取液在下層。

5.3試樣凈化

取2.

0mL提取液,加入47mL吐溫-20/PBS溶液(3.2.7),混合均勻后過免疫親和柱,流速控制在

1mL/min~3mL/min,用10mLPBS緩沖液淋洗免疫親和柱,分別用1mL甲醇-乙酸溶液(3.2.4)洗

脫免疫親和柱三次,收集洗脫液,

55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(3.2.3)溶解殘渣。渦旋

30s,過0.45μm微孔濾膜后,收集于進樣瓶中,待測。

注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同,實際操作時,請參照廠商提供的操作說明和程序使用。

5.4儀器參考條件

色譜柱:

C18色譜柱:250mm×4.6mm,5μm,或相當(dāng)者。

檢測波長:激發(fā)波長335nm;發(fā)射波長440nm。

流動相:A:甲酸水溶液(

3.2.1);B:甲醇。梯度洗脫,洗脫程序見表1。

流動相流速:

0.8mL/min。

衍生液流速:

0.4mL/min。

柱溫:

40℃。

反應(yīng)器溫度:

40℃。

進樣量:

50μL。

表1流動相洗脫程序

時間

min

流動相A

%

流動相B

%

0.0045.055.0

2.0045.055.0

9.0030.070.0

14.0010.090.0

14.5010.090.0

15.0045.055.0

22.0045.055.0

5.5試樣溶液的測定

在5.

4項色譜條件下,將50.0μL系列伏馬毒素混合標(biāo)準工作溶液(3.4.3)按濃度從低到高依次注

入高效液相色譜儀;待儀器條件穩(wěn)定后,以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)(

x軸),目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐

標(biāo)(

y軸),對各個數(shù)據(jù)點進行最小二乘線性擬合,標(biāo)準工作曲線按式(1)計算:

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4

y=ax+b

………………(1)

式中:

y———目標(biāo)物質(zhì)的峰面積比;

a———回歸曲線的斜率;

x———目標(biāo)物質(zhì)的濃度;

b———回歸曲線的截距。

標(biāo)準工作溶液和樣液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi),如果樣品含量超過標(biāo)準曲線

范圍,需稀釋后再測定。

5.6空白試驗

不稱取試樣,按5.

2和5.3的步驟做空白實驗。應(yīng)確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

6分析結(jié)果的表述

待測樣品中FB

1、FB2、FB3的含量按式(2)計算:

X=

ci×V×f

m

…………(2)

式中:

X———待測樣品中FB1、FB2、FB3的含量,單位為微克每千克(

μg

/

kg

);

ci———待測物進樣液中FB1、FB2、FB3的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

V———定容體積,單位為毫升(mL);

f

———試液稀釋倍數(shù);

m———樣品的稱樣量,單位為克(g)。

注:計算結(jié)果需扣除空白值,測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示,保留兩位有效數(shù)字。

7精密度

樣品中伏馬毒素含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值

的20%。

8其他

當(dāng)稱樣量為5g時,FB

1、FB2、FB3的檢出限分別為17μg

/

kg

、

8μg/

kg

、

8μg/

kg

;定量限分別為

50μg/

kg

、

25μg/

kg

、

25μg/

kg

。

第二法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

9原理

樣品加入同位素內(nèi)標(biāo),乙腈-水溶液提取,經(jīng)稀釋后過免疫親和柱或強陰離子交換固相萃取柱凈化,

去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)。凈化液中的伏馬毒素經(jīng)過高效液相色譜分離,串聯(lián)

質(zhì)譜檢測,同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

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10試劑和材料

除非另有說明,本方法使用的試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

10.1試劑

10.1.1甲醇(CH3OH):色譜純。

10.1.2乙腈(CH3CN):色譜純。

10.1.3乙酸(CH3COOH)。

10.1.4氯化鈉(NaCl)。

10.1.5磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。

10.1.6磷酸二氫鉀(KH2PO4)。

10.1.7氯化鉀(KCl)。

10.1.8吐溫-20(C58H114O26)。

10.2溶液配制

10.2.1甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,溶于1L水,混合均勻。

10.2.2乙腈-甲醇溶液(50+50):分別量取500mL甲醇和500mL乙腈,混合均勻。

10.2.3乙腈-水溶液(50+50):分別量取500mL乙腈和500mL水,混合均勻。

10.2.4乙腈-水溶液(20+80):分別量取200mL乙腈和800mL水,混合均勻。

10.2.5甲醇-水溶液(60+20):分別量取600mL甲醇和200mL水,混合均勻。

10.2.6甲醇-乙酸溶液(99+1):吸取1mL乙酸,加入到99mL甲醇中,混合均勻。

10.2.7甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均勻。

10.2.8磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀,用

980mL水溶解,用鹽酸調(diào)整

pH

至7.

4,用水稀釋至1000mL,混合均勻。

10.2.9吐溫-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐溫-20,加入磷酸鹽緩沖液(10.2.8)并稀釋至1000mL,混

合均勻。

10.3標(biāo)準品

10.3.1FB1、FB2、FB3標(biāo)準品

伏馬毒素B

1(FB1,C34H59NO15),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

伏馬毒素B

2(FB2,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

伏馬毒素B

3(FB3,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

10.3.213C34-伏馬毒素B1、B2、B3同位素內(nèi)標(biāo)

13C

34-伏馬毒素B1(

13C

34-FB1,C34H59NO15),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

13C

34-伏馬毒素B2(

13C

34-FB2,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

13C

34-伏馬毒素B3(

13C

34-FB3,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

注:在檢測中可以只使用13C34-FB1一種同位素內(nèi)標(biāo),但需要對被測定試樣基質(zhì)進行加標(biāo)實驗,評估和確定13C34-FB1

與其他被測伏馬毒素的基質(zhì)效應(yīng)?；蚴褂没|(zhì)匹配校正曲線。

10.4標(biāo)準溶液配制

10.4.1標(biāo)準儲備溶液(0.1mg/mL):分別準確稱取FB1、FB2、FB3各0.01g(精確至0.0001g)至小燒

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杯中,用乙腈-水溶液(10.

2.3)溶解,并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光

-20℃保存。有效期6個月。

10.4.2混合標(biāo)準溶液:準確吸取FB1標(biāo)準儲備液1mL、FB2和FB3標(biāo)準儲備液0.5mL至同一10mL

容量瓶中,加乙腈-水溶液(10.

2.3)稀釋至刻度,得到FB1濃度為10μg/mL、FB2和FB3濃度分別為

5μg/mL的混合標(biāo)準溶液。再稀釋10倍,得到FB1濃度為1μg/mL、FB2和FB3濃度分別為0.5μg/mL

的混合標(biāo)準溶液。此溶液密封后避光4℃保存。有效期6個月。

10.4.3混合同位素標(biāo)準溶液:準確吸取13C34-FB1(25μg/mL)、

13C

34-FB2(10μg

/mL)、

13C

34-FB3

(

10μg/mL)各1mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(10.2.3)稀釋至刻度,得到含13C34-FB1

2.5μg/mL、

13C

34-FB2和

13C

34-FB31μg

/mL的混合同位素標(biāo)準溶液。再稀釋10倍,得到含13C

34-FB1

250ng

/mL、

13C

34-FB2和

13C

34-FB3100ng

/mL的混合同位素標(biāo)準工作溶液。有效期6個月。

10.4.4混合標(biāo)準工作溶液:準確吸取混合標(biāo)準溶液,用乙腈-水溶液(10.2.4)稀釋,加入混合同位素標(biāo)

準工作溶液(

10.4.3),配制成FB1濃度依次為20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、

400ng

/mL,

FB2和FB3濃度依次為10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL

的系列混合標(biāo)準工作溶液,每個標(biāo)準工作溶液中含有13C

34-FB125ng

/mL、

13C

34-FB2和

13C

34-FB3

10ng

/mL。

11儀器和設(shè)備

11.1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源。

11.2天平:感量0.01g和0.0001g。

11.3均質(zhì)器。

11.4振蕩器。

11.5氮吹儀。

11.6離心機:轉(zhuǎn)速≥4000r/min。

11.7強陰離子交換固相萃取柱(硅膠基,6mL,500mg)。

11.8免疫親和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)。(柱容量及柱回收率驗證方法參見附錄B)

注:對于每個批次的親和柱在使用前需進行質(zhì)量檢驗。

11.9微孔濾膜:0.22μm,有機型。

12分析步驟

12.1樣品制備

將固體樣品按四分法縮分至1kg,全部用谷物粉碎機磨碎并細至粒度小于1mm,混勻分成2份作

為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封,標(biāo)識后置于4℃下避光保存。

玉米油樣品直接取2份作為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封,標(biāo)識后置于4℃下避光保存。

在制樣的操作過程中,應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

12.2試樣提取

準確稱取固體樣品5g(精確至0.

01g)樣品于50mL離心管中,加入混合同位素標(biāo)準工作溶液

(

10.4.3)400μL,加入20mL乙腈-水溶液(10.2.3),渦旋或振蕩提取20min,取出后,在4000r/min下

離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。

玉米油樣品操作同固體樣品,提取液在下層。

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12.3試樣凈化

12.3.1免疫親和柱凈化

取2.

0mL提取液,加入47mL吐溫-20/PBS溶液(10.2.9),混合均勻后過免疫親和柱,流速控制在

1mL/min~3mL/min,用10mLPBS緩沖液(10.2.8)淋洗免疫親和柱,分別用1mL甲醇-乙酸溶液

(

10.2.7)洗脫免疫親和柱三次,收集洗脫液,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(10.2.4)溶解殘

渣。渦旋30s,過0.

22μm微孔濾膜后,收集于進樣瓶中,待測。

注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同,實際操作時,請參照廠商提供的操作說明和程序使用。

12.3.2強陰離子交換固相萃取柱凈化

取3mL提取液,加入8mL甲醇-水溶液(10.

2.5),混合均勻后過強陰離子交換固相萃取柱(使用前

按要求活化),分別用8mL甲醇-水溶液(10.

2.5)和3mL甲醇淋洗,用10mL甲醇-乙酸溶液(10.2.6)洗

脫,

55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(10.2.4)溶解殘渣。渦旋30s,過0.22μm微孔濾膜后,收

集于進樣瓶中,待測。

12.4儀器參考條件

12.4.1液相色譜條件

色譜柱:

C18柱,100mm×2.1mm,1.7μm,或相當(dāng)者。

流動相:A:甲酸水溶液(

0.1%);B:乙腈-甲醇溶液(50+50)。梯度洗脫,梯度見表2。

流速:

0.35mL/min。

柱溫:

30℃。

進樣量:

10μL。

表2流動相梯度洗脫程序

時間

min

流動相A

%

流動相B

%

0.0070.030.0

2.3030.070.0

4.0030.070.0

4.200100

4.800100

5.0070.030.0

12.4.2質(zhì)譜參數(shù)

離子化模式:電噴霧電離正離子模式(

ESI+)。

質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)。

監(jiān)測離子對信息見表3,其他儀器參考條件見附錄C。

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表3質(zhì)譜參數(shù)

毒素名稱母離子

定量

子離子

碰撞能量

eV

定性

子離子

碰撞能量

eV

FB17223522533435

FB27063363535430

FB37063363535430

13C

34-FB17563743535640

13C

34-FB27403583537630

13C

34-FB37403583537630

12.5定性判定

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對樣品進行定性判定,在相同試驗條件下,樣品中應(yīng)呈現(xiàn)定量離子對

和定性離子對的色譜峰,被測物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間與標(biāo)準溶液中對應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時

間一致;樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準溶液的離子相對豐度比的偏

差不超過表4規(guī)定范圍,則可以判斷樣品中存在對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)。

表4定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度(

k)k≥50%50%>k≥20%20%>k≥10%k≤10%

允許的最大偏差

±20%±25%±30%±50%

12.6定量測定

在5.

4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下,將10.0μL系列伏馬毒素混合標(biāo)準溶液(10.4.4)按濃度

從低到高依次注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀;待儀器條件穩(wěn)定后,以目標(biāo)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)

(

x軸),目標(biāo)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)(y軸),對各個數(shù)值點進行最小二乘線性擬合,標(biāo)準工作

曲線按式(

3)計算:

y=ax+b

………………(3)

式中:

y———目標(biāo)物質(zhì)/內(nèi)標(biāo)的峰面積比;

a———回歸曲線的斜率;

x———目標(biāo)物質(zhì)/內(nèi)標(biāo)的濃度比;

b———回歸曲線的截距。

標(biāo)準工作溶液和樣液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi),如果含量超過標(biāo)準曲線范圍,

則重新取樣,增加相應(yīng)內(nèi)標(biāo)添加量,使內(nèi)標(biāo)濃度與待測液濃度相匹配,然后稀釋到適當(dāng)濃度后分析。

12.7空白試驗

不稱取試樣,按12.

2和12.3的步驟做空白實驗。應(yīng)確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

GB5009.240—2016

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13分析結(jié)果的表述

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。

含量按式(

4)計算:

X=

c×ci×A×Asi×V

csi×Ai×As×m

…………(4)

式中:

X

———樣品中待測組分的含量,單位為微克每千克(

μg

/

kg

);

c

———標(biāo)準溶液中待測組分的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

ci

———測定液中待測組分的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

A

———測定液中待測組分的峰面積;

Asi———標(biāo)準溶液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積;

V

———定容體積,單位為毫升(mL);

csi

———標(biāo)準溶液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

Ai———測定液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積;

As———標(biāo)準溶液中待測組分的峰面積;

m

———樣品稱樣量,單位為克(

g)。

注:計算結(jié)果需扣除空白值,測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示,保留兩位有效數(shù)字。

14精密度

樣品中伏馬毒素含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值

的20%。

15其他

當(dāng)稱樣量為5g時,FB

1、FB2、FB3的檢出限分別為7μg

/

kg

、

3μg/

kg

、

3μg/

kg

;定量限分別為

20μg/

kg

、

10μg/

kg

、

10μg/

kg

。

第三法免疫親和層析凈化-柱前衍生高效液相色譜法

16原理

樣品用乙腈-水溶液提取,經(jīng)稀釋后過免疫親和柱凈化,去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干

擾物質(zhì)。凈化液中的伏馬毒素經(jīng)過OPA衍生后進高效液相色譜分離,熒光檢測,外標(biāo)法定量。

17試劑和材料

除非另有說明,本方法使用的試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

17.1試劑

17.1.1甲醇(CH3OH):色譜純。

GB5009.240—2016

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17.1.2乙腈(CH3CN):色譜純。

17.1.3乙酸(CH3COOH)。

17.1.4氫氧化鈉(NaOH)。

17.1.5氯化鈉(NaCl)。

17.1.6磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。

17.1.7磷酸二氫鉀(KH2PO4)。

17.1.8氯化鉀(KCl)。

17.1.9硼砂(Na2B4O7·10H2O)。

17.1.102-巰基乙醇(C2H6OS)。

17.1.11鄰苯二甲醛(OPA,C8H6O2)。

17.1.12吐溫-20(C58H114O26)。

17.2溶液配制

17.2.1甲酸銨-甲酸水溶液(0.1mol

/L,

pH

:

3.3):稱取6.3g甲酸銨,溶于980mL水中,用甲酸調(diào)

pH

至3.

3,用水稀釋至1000mL,混合均勻。

17.2.2乙腈-水溶液(50+50):分別量取500mL乙腈和500mL水,混合均勻。

17.2.3乙腈-水溶液(20+80):分別量取200mL乙腈和800mL水,混合均勻。

17.2.4甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均勻。

17.2.5氫氧化鈉(1mol

/L)溶液:準確稱取氫氧化鈉4.

0g,溶于100mL

水,混合均勻。

17.2.6磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀,用

980mL水溶解,然后用鹽酸調(diào)整

pH

至7.

4,最后用水稀釋至1000mL,混合均勻。

17.2.7吐溫-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐溫-20,加入磷酸鹽緩沖液(17.2.6)并稀釋至1000mL,混

合均勻。

17.2.8硼砂溶液(0.1mol

/L):稱取硼砂3.

8g,用水溶解并稀釋至100mL,混合均勻。

17.2.9衍生溶液:準確稱取40mg鄰苯二甲醛,溶于1mL的甲醇中,用硼砂溶液(0.1mol

/L)(

17.2.8)

5mL稀釋,加入2-巰基乙醇50μL,混合均勻,裝入棕色瓶中,現(xiàn)用現(xiàn)配。

17.3標(biāo)準品

FB1、FB2、FB3標(biāo)準品:

伏馬毒素B

1(FB1,C34H59NO15),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

伏馬毒素B

2(FB2,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

伏馬毒素B

3(FB3,C34H59NO14),純度≥95%,或有證標(biāo)準溶液。

17.4標(biāo)準溶液配制

17.4.1標(biāo)準儲備溶液(0.1mg/mL):分別準確稱取FB1、FB2、FB3各0.01g(精確至0.0001g)至小燒

杯中,用乙腈-水溶液(

17.2.2)溶解,并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保

存。有效期6個月。

17.4.2混合標(biāo)準溶液:準確吸取FB1標(biāo)準儲備液1mL、FB2和FB3標(biāo)準儲備液各0.5mL至同一10mL

容量瓶中,加乙腈-水溶液(17.

2.2)稀釋至刻度,得到FB1濃度為10μg/mL、FB2和FB3濃度分別為

5μg/mL的混合標(biāo)準溶液。再稀釋10倍,得到FB1濃度為1μg/mL、FB2和FB3濃度為0.5μg/mL的

混合標(biāo)準溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6個月。

GB5009.240—2016

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17.4.3混合標(biāo)準工作液:準確吸取混合標(biāo)準溶液,用乙腈-水溶液(17.2.3)稀釋,配制成FB1濃度依次

為20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB

2和FB3濃度依次為

10ng

/mL、

40ng

/mL、

80ng

/mL、

120ng

/mL、

160ng

/mL、

200ng

/mL的系列混合標(biāo)準工作溶液。

18儀器和設(shè)備

18.1高效液相色譜儀,帶熒光檢測器。

18.2天平:感量0.01g和0.0001g。

18.3均質(zhì)器。

18.4振蕩器。

18.5氮吹儀。

18.6離心機:轉(zhuǎn)速≥4000r/min。

18.7免疫親和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)(柱容量及柱回收率驗證方法參見附錄A.2)。

注:對于每個批次的親和柱在使用前需進行質(zhì)量驗證。

18.8微孔濾膜:0.45μm,有機型。

18.9秒表。

19分析步驟

19.1樣品制備

將固體樣品按四分法縮分至1kg,全部用谷物粉碎機磨碎并細至粒度小于1mm,混勻分成2份作

為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封,標(biāo)識后置于4℃下避光保存。

玉米油樣品直接取2份作為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封,標(biāo)識后置于4℃下避光保存。

在制樣的操作過程中,應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

19.2試樣提取

準確稱取固體樣品5g(精確至0.

01g)樣品于50mL離心管中,加入20mL乙腈

-水(17.2.2),渦旋

或震蕩提取20min,取出后,在4000r/min下離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。

玉米油樣品操作同固體樣品,提取液在下層。

19.3試樣凈化

取2.

0mL提取液,加入47mL吐溫-20/PBS溶液(17.2.7),混合均勻后過免疫親和柱,流速控制在

1mL/min~3mL/min,用10mLPBS緩沖液淋洗免疫親和柱,分別用1mL甲醇-乙酸溶液(17.2.4)洗

脫免疫親和柱三次,收集洗脫液,

55℃下氮吹至干,加入500μL乙腈-水溶液(17.2.2)溶解殘渣。渦旋

30s,過0.45μm微孔濾膜后,收集于進樣瓶中,待測。

注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同,實際操作時,請參照廠商提供的操作說明和程序使用。

19.4衍生

取100μL標(biāo)準溶液或樣品溶液于進樣瓶中,加入100μL衍生溶液(17.

2.9),渦旋混合30s,在

2min內(nèi)進樣分析。

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19.5儀器參考條件

色譜柱:

C18柱,150mm×4.6mm,5μm或相當(dāng)者。

檢測波長:激發(fā)波長335nm;發(fā)射波長440nm。

流動相:A:甲酸銨-甲酸水溶液(

17.2.1);B:甲醇。梯度洗脫,洗脫程序見表5。

流速:

1.0mL/min。

柱溫:

40℃。

進樣量:

50μL。

表5流動相洗脫程序

時間

min

流動相A

%

流動相B

%

0.0030.070.0

5.0028.072.0

6.0025.075.0

11.0022.078.0

11.1030.070.0

16.0030.070.0

19.6試樣溶液的測定

在12.

4色譜條件下,將50.0μL伏馬毒素系列混合標(biāo)準工作溶液(17.4.3)按濃度從低到高依次注

入高效液相色譜儀;待儀器條件穩(wěn)定后,以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)(

x軸),目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐

標(biāo)(

y軸),對各個數(shù)據(jù)點進行最小二乘線性擬合,標(biāo)準工作曲線:

y=ax+b

………………(5)

式中:

y———目標(biāo)物質(zhì)的峰面積比;

a———回歸曲線的斜率;

x———目標(biāo)物質(zhì)的濃度;

b———回歸曲線的截距。

標(biāo)準工作溶液和樣液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi),如果樣品含量超過標(biāo)準曲線

范圍,需稀釋后再測定。

19.7空白試驗

不稱取試樣,按19.

2和19.3的步驟做空白實驗。應(yīng)確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

20分析結(jié)果的表述

X=

ci×V×f

m

…………(6)

式中:

X———待測樣品中FB1、FB2、FB3的含量,單位為微克每千克(

μg

/

kg

);

GB5009.240—2016

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ci———待測物進樣液中FB1、FB2、FB3的濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

V———定容體積,單位為毫升(mL);

f

———試液稀釋倍數(shù);

m———樣品的稱樣量,單位為克(g)。

注:計算結(jié)果需扣除空白值,測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示,保留兩位有效數(shù)字。

21精密度

樣品中伏馬毒素含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值

的20%。

22其他

當(dāng)稱樣量為5g時,FB

1、FB2、FB3的檢