1、，酶標(biāo)記器的使用，主要內(nèi)容，1，ELISA方法介紹2，酶標(biāo)記器和多功能酶標(biāo)記器3，儀器操作，1，ELISA方法介紹，經(jīng)典化學(xué)分析方法(如滴定分析、重量分析、分光光度法)對(duì)化學(xué)體系成分進(jìn)行常數(shù)或微量分析在這種背景下，科學(xué)家們具有免疫化學(xué)法(如酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法、放射免疫法)牙齒高特異性、超微量分析有機(jī)成分的特點(diǎn)，因此迅速普及和發(fā)展。1971年，人們建立了用酶標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)，使原本極微小的抗原或抗體能在幾分鐘后識(shí)別出來(lái)，進(jìn)行定量。牙齒技術(shù)稱為酶聯(lián)合免疫吸附試驗(yàn)法，又名ELISA。酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immuno-sor bent assay)酶聯(lián)免疫法的專用儀器是

2、酶標(biāo)儀。分析原理、酶標(biāo)儀的分析原理與分光光度法一樣，服從朗伯維爾定律。物質(zhì)的含量與發(fā)色液的顏色濃度成正比，顏色的濃度可以用吸光度表示，因此物質(zhì)的含量與吸光度值成正比。酶對(duì)抗原或抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)后，與基質(zhì)的結(jié)合物在特定波長(zhǎng)有最大吸收，可以通過(guò)發(fā)色液的吸光度測(cè)定定量測(cè)定物。ELISA法律知識(shí)，1 .免疫學(xué)知識(shí)2。常用ELISA分析3。ELISA應(yīng)用程序節(jié)目，1 .免疫學(xué)知識(shí)，抗體是什么？什么是抗原？什么是抗原抗體反應(yīng)？什么是抗體(Antibody)？抗體是機(jī)體受到抗原刺激后，能與體液中出現(xiàn)的相應(yīng)抗原反應(yīng)的球蛋白，稱為免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)。人類免疫球蛋白有五種茄子類別：

3、IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。含有免疫球蛋白的血清稱為免疫血清。免疫球蛋白(Ig)、免疫球蛋白(Ig)是機(jī)體受到抗原刺激而產(chǎn)生的，主要作用是引起抗原和免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物?？梢苑乐共≡w對(duì)機(jī)體的危害，引起過(guò)敏反應(yīng)或其他有害反應(yīng)。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)，免疫球蛋白都是大分子的物質(zhì)，輕鏈，重鏈，抗原結(jié)合的部位?？乖鞘裁?？能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并結(jié)合抗體和特異性的物質(zhì)稱為抗原。物質(zhì)具有的這種特性稱為抗原性?？乖奈镔|(zhì)可以牙齒為機(jī)體本身的成分，如蛋白質(zhì)、酶、多肽或多糖。也有外來(lái)抗原(如病毒、污染物)?？乖奶禺愋?，各種抗原物質(zhì)的化學(xué)構(gòu)成復(fù)雜，但刺激機(jī)體生成抗體，與抗體反應(yīng)相結(jié)合的化學(xué)構(gòu)成只是

4、抗原物質(zhì)表面的活性化學(xué)基團(tuán)、化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，被稱為抗原物質(zhì)決定簇。分子結(jié)構(gòu)的差異決定了各種物質(zhì)抗原的特異性。抗原抗體反應(yīng)，抗原和抗體的反應(yīng)統(tǒng)稱為免疫學(xué)反應(yīng)。體內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。沒有抗原刺激，身體就不能產(chǎn)生抗體?？梢岳每贵w檢測(cè)抗原物質(zhì)。ELISA法基于抗原和抗體免疫學(xué)反應(yīng)，具有特異性的特點(diǎn)。測(cè)量需要酶標(biāo)記抗原或抗體，因此酶分子和抗原或抗體分子的結(jié)合物能促進(jìn)基質(zhì)分子的反應(yīng)，引起擴(kuò)增作用，正是由于這種擴(kuò)增作用，牙齒法變得非常敏感。2 .常用ELISA分析，1)?？乖瓬y(cè)定2)?？贵w測(cè)定，(1)抗原測(cè)定，A在固相表面吸附抗體的過(guò)程稱為包皮。添加

5、b抗原形成抗原-抗體復(fù)合物。c加酶標(biāo)準(zhǔn)抗體。d酶反應(yīng)的氣質(zhì)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)液的顏色很深，與抗原的含量成正比。主要階段，1 .涂層抗體酶標(biāo)(一元)。2.添加要測(cè)試的抗原?？乖贵w反應(yīng)，洗滌。添加酶標(biāo)記抗體(二項(xiàng)式)。反應(yīng)，洗滌。4.添加發(fā)色氣質(zhì)(三元)、反應(yīng)、洗滌。5.加終止液。酶標(biāo)記器讀取吸光度值。7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定抗原。(2)抗體測(cè)定，抗原包被放在酶標(biāo)上。添加b抗體形成抗原抗體復(fù)合物。c加酶標(biāo)準(zhǔn)抗體(一元)D加酶底物(二元)，發(fā)色，比色。3 .ELISA方法的應(yīng)用，原則上ELISA可用于檢測(cè)所有抗原、抗體和抗原，并可直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。在實(shí)際應(yīng)用中，與醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、免疫

6、學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、環(huán)境學(xué)等密切相關(guān)。例如醫(yī)學(xué)方面：腫瘤研究中的甲胎蛋白檢測(cè)；檢測(cè)過(guò)敏原。檢測(cè)血清白蛋白和免疫球蛋白；在傳染病診斷中檢查乙型肝炎表面抗原。環(huán)境科學(xué)：在污染物抗原的干預(yù)下測(cè)定生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、酶的變化。其他：在植物組織漿液中檢查植物病毒；一般比色分析。2，酶標(biāo)記器和多功能酶標(biāo)記器，一般酶標(biāo)記器多功能酶標(biāo)記器，1。一般酶標(biāo)(ELISA Reader)、Bio-Rad模型550，4 550，4萬(wàn)韓元、光源、光電探測(cè)器光源：鎢燈過(guò)濾器：常用波長(zhǎng)范圍：405nm 450nm(四甲基聯(lián)苯胺)490nm僅在固定波長(zhǎng)的可見光范圍內(nèi)測(cè)量?？梢詫?duì)化學(xué)物質(zhì)和生命成分進(jìn)行終點(diǎn)站分析。酶標(biāo)記器的應(yīng)用

7、，一般酶標(biāo)記器的基本功能有兩個(gè)。(1)相當(dāng)于分光光度計(jì)：化合物含量測(cè)定或細(xì)胞存活率測(cè)定等。(2)基于免疫反應(yīng)的ELISA分析。新型多功能酶標(biāo)記機(jī)的價(jià)格達(dá)20 50萬(wàn)韓元，分析功能廣泛擴(kuò)大，對(duì)酶標(biāo)記機(jī)的應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義。ELISA的局限性，世界衛(wèi)生組織專家組提出了對(duì)ELISA的評(píng)價(jià)?！癊LISA是免疫診斷應(yīng)用程序的好方法，但做得好并不容易?！?.對(duì)ELISA法的非特異性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)還不完善，因此當(dāng)存在非特異性反應(yīng)時(shí)，往往很難解釋。2.固相載體的質(zhì)量總是不統(tǒng)一的。主要原料和制備工藝不一致，徐璐不同批次的固相載體有時(shí)本底值高，有時(shí)吸附性能差，影響試驗(yàn)結(jié)果。3.試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙交叉，各顯神通”

8、，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。2 .多用途酶指示器，Thermo公司電波場(chǎng)多用途酶指示器，50萬(wàn)韓元以上，多用途酶指示器的特征，1。用色杯或微板(6，12，24，48，96，384孔微板)，測(cè)量量大。2.有200-1000 nm、紫外線可見光、熒光、偏振等，波長(zhǎng)變化達(dá)1nm，如果是有色溶液，則可以測(cè)量吸光度。3.提供終點(diǎn)站檢測(cè)、動(dòng)力學(xué)、單孔掃描、頻譜掃描等讀出模式。4.分析功能已擴(kuò)展。多功能酶標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)例，DNA/RNA定量和純度檢查Bradford /Lowry實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性檢查MTT分析(IC50/LD50)細(xì)菌生長(zhǎng)分析鈣流檢測(cè)膜前衛(wèi)檢查雙熒光素酶報(bào)告基因分析，多功能酶標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

9、，ATP檢測(cè)微生物生長(zhǎng)注意事項(xiàng)2。酶標(biāo)記板3。操作要點(diǎn)，1 .注意事項(xiàng)，1)重復(fù)試劑盒說(shuō)明，熟悉操作程序。2)樣品的準(zhǔn)確度。操作中，發(fā)色劑和終止的加成量準(zhǔn)確，最好使用加色槍加色液，以確保顏色時(shí)吸光度的準(zhǔn)確性。不要混用槍頭。洗滌時(shí)間。一般按照說(shuō)明書至少要洗5次，烘干余額。4)觀察和解釋吸光度結(jié)果應(yīng)在15min內(nèi)完成。否則液體顏色會(huì)減少。5)要測(cè)試的生物樣品應(yīng)放在4個(gè)冰浴中。6)發(fā)色液目前配制，要避光，低溫保存。7)注意購(gòu)買抗體的保存。，2 .酶表盤、酶表盤材料、水溶性抗原或抗體吸附在固相載體上，成為不溶性形態(tài)，是酶表盤測(cè)定的基本條件。很多物質(zhì)，例如纖維素、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、

10、聚乙烯和聚氯乙烯，都可以用作固相載體。但是在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。微量反應(yīng)板使用的測(cè)試劑量較小，操作方便，適合大規(guī)模應(yīng)用。酶標(biāo)板材料、國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板(上海塑料3廠生產(chǎn))目前大量應(yīng)用于ELISA測(cè)量，取得了滿意的結(jié)果。但是，每個(gè)微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白的吸附性能有很大差異。實(shí)驗(yàn)表明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面的性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料產(chǎn)品在加工過(guò)程中，工藝不同或受其他因素的影響，導(dǎo)致吸附性能的巨大差異，甚至完全喪失吸附能力。酶標(biāo)鑒定，對(duì)各產(chǎn)品部署使用前必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是用檢驗(yàn)試劑箱檢驗(yàn)購(gòu)買的微量反應(yīng)板樣品，顯示顏色，停止反應(yīng)，然后在酶

11、表示儀中測(cè)定其O.D值。(阿爾伯特愛因斯坦、美國(guó)電視電視劇、檢查箱、檢查箱、檢查箱、檢查箱)，一般認(rèn)為整個(gè)主板上兩個(gè)孔之間的O.D值的誤差不超過(guò)10%。如果中間孔和周圍孔O.D值之間的差異太大，或者反應(yīng)板的一側(cè)與另一側(cè)凹孔的O.D值之間的差異很大，則不合格。此外，還要確認(rèn)陽(yáng)性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差異。一般來(lái)說(shuō)，10倍左右的差異應(yīng)該是合格的。酶標(biāo)記機(jī)單，雙波長(zhǎng)檢測(cè)，普通酶標(biāo)記機(jī)都有短波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)模式，為什么呢？酶標(biāo)儀為垂直光路，測(cè)量的樣品液面是否水平，酶標(biāo)板滲透性，孔底是否平坦等影響較大。要測(cè)量吸光度A0，請(qǐng)選擇630nm作為基準(zhǔn)波長(zhǎng)。在測(cè)量波長(zhǎng)(例如，490nm/450nm)下測(cè)量

12、樣品的吸光度A，進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)量后，采取兩者的差異，測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于短波長(zhǎng)下的測(cè)量，實(shí)驗(yàn)誤差較小。用于ELISA測(cè)量的基座(例如鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺)，顏色結(jié)束后630nm的吸光度值只有吸收棒(490nm/450nm)吸光度值的1%以下，因此使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)也不會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。一般酶標(biāo)儀比色應(yīng)首選雙波長(zhǎng)。酶標(biāo)記機(jī)的工作環(huán)境，1。儀器應(yīng)放置在沒有強(qiáng)磁場(chǎng)和干擾電壓的位置。儀器應(yīng)置于噪音小于40分貝的環(huán)境中。3.為了減緩光學(xué)元件的老化，必須避免陽(yáng)光直射。4.工作環(huán)境溫度必須在1540%和15%之間。操作中電壓必須保持穩(wěn)定。為了避免水蒸氣、煤煙，請(qǐng)清潔周圍的空氣。7.保持干燥、清潔、水平工作臺(tái)和

13、足夠的工作空間。3 .BIO-RAD模型550酶指示器運(yùn)行，1 .打開電源，打開酶指示器開關(guān)。裝置開始自檢。Self disgonsis in progress 3。按箭頭光標(biāo)移動(dòng)到Mode，然后設(shè)置參數(shù)。在set analysis mode(設(shè)置分析模式)中顯示裝置后，按enter鍵確認(rèn)。4.選擇波長(zhǎng)測(cè)量類型。按箭頭光標(biāo)移動(dòng)到D/S，按select鍵選中它，然后按enter鍵確認(rèn)。光標(biāo)按雙/單、雙波長(zhǎng)選擇、選擇、enter確定。5 .選擇過(guò)濾器波長(zhǎng)。牙齒酶標(biāo)有4個(gè)波長(zhǎng)：1:405nm；2:450nm3:490nm4:630nm。按箭頭光標(biāo)移動(dòng)到Filt，按select鍵選擇它，然后按ente

14、r鍵確認(rèn)。光標(biāo)顯示在Mes=#X Ref=# Y處。光標(biāo)選擇數(shù)字3，即490nm的測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)，enter牙齒確定。再次按下Next，Ref，然后按游標(biāo)以選取參考波長(zhǎng)。例如，數(shù)字4 .是630nm，enter決定。6.選擇是否混合。將箭頭光標(biāo)按Mix鍵，按select鍵將其選中，然后按enter鍵確認(rèn)。光標(biāo)出現(xiàn)在yes/No處。例如，如果光標(biāo)選擇“否”，然后按select鍵選擇，則指示enter不混合樣例。7 .返回原始顯示。set analysis中的D/S FiltMix。按enter顯示set analysis的Mode。說(shuō)明機(jī)器已經(jīng)達(dá)到測(cè)試狀態(tài)。8.打開測(cè)量蓋，將酶標(biāo)小心地放入測(cè)量桶中，然后合宿。9.好的酶標(biāo)記物專用感光印刷紙。10.按Start鍵開始吸光度測(cè)定，并自動(dòng)打印測(cè)量結(jié)果。11.測(cè)量完成后，取出酶板，合上蓋子，關(guān)閉儀器開關(guān)和電源，蓋上灰塵蓋。4 .Thermo多功能酶標(biāo)儀的操作，1 .打開電源，然后單擊SkanIt RE for Varioskan fl