1、質(zhì)粒DNA抽提實(shí)驗(yàn)報(bào)告1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握堿裂解法小量快速提取質(zhì)粒DNA的方法，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切，PCR擴(kuò)增等。2.學(xué)習(xí)利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測(cè)DNA的純度，構(gòu)型，含量和分子量大小。2 實(shí)驗(yàn)原理：堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DN結(jié)果A的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏

2、連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：1.5mlEP管、高速離心機(jī)、移液槍溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS溶液III： 3 mol/L NaAc （pH4.8）溶液、TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA4 實(shí)驗(yàn)步驟:1、 取1.5ml細(xì)胞培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，12000rpm/min離心1

3、min，去上清液（重復(fù)一次）2、加200l溶液重懸浮細(xì)胞3、加200l溶液，輕輕搖勻，放置5min4、加150l溶液，輕輕搖勻，冰浴5min，12000rpm/min離心5min5、取上清，加入等體積氯仿，搖勻，12000rpm/min離心10min6、去上清，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，12000rpm/min離心10min7、70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干8、加20ddH2O溶解沉淀，-20下保存?zhèn)溆梦鍖?shí)驗(yàn)結(jié)果：得到大腸桿菌質(zhì)粒DNAPCR以及電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告1 實(shí)驗(yàn)原理：PCR：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈D

4、NA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板53方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。 電泳：瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是比較大的，對(duì)蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對(duì)電泳遷移率的影響相對(duì)較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來(lái)進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、R

5、NA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。二實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：EP管、離心機(jī)、PCR儀、電泳槽、電泳儀、移液槍、紫外透射檢測(cè)儀等DNA模板、與特定DNA模板結(jié)合的引物、去離子水、商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液、dNTP、DNA熒光染料溴化乙錠、瓊脂糖凝膠3 PCR反應(yīng)體系（25l）2PCRmix 12.5l引物1 1l引物2 1l20ddH2O 10.5l4 操作步驟1、94預(yù)變性5min，然后94，30s-64，45s-72，1min循環(huán)7次2、94，30s-55，45s-72，1min循環(huán)23次3、72，10s4、 電泳檢測(cè)5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表：如右圖所示：實(shí)驗(yàn)所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，實(shí)驗(yàn)的DNA條帶位置