中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅１５１９３．５—２０１４

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

２０１４１２２４發(fā)布２０１５０５０１實(shí)施

中華人民共和國

國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

發(fā)布

犌犅１５１９３．５—２０１４

Ⅰ

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替ＧＢ１５１９３．５—２００３《骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與ＧＢ１５１９３．５—２００３相比，主要變化如下：

———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)”；

———修改了范圍；

———增加了術(shù)語和定義；

———增加了試驗(yàn)報(bào)告；

———增加了試驗(yàn)的解釋；

———修改了試驗(yàn)?zāi)康暮驮恚?/p>

———修改了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；

———修改了給予程序；

———修改了標(biāo)本制作；

———修改了閱片的內(nèi)容。

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１

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價(jià)受試物的遺傳毒性作用。

２術(shù)語和定義

２．１微核

細(xì)胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍留在細(xì)胞質(zhì)中的整條染色單體或

染色體的無著絲斷片或環(huán)。在末期單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成。

２．２著絲粒

在細(xì)胞分裂期染色體與紡錘體纖維連接的區(qū)域，以使子染色體有序移動(dòng)到子細(xì)胞兩極。

２．３正染紅細(xì)胞

成熟的紅細(xì)胞，其缺乏核糖體并可用選擇性核糖體染料與未成熟的嗜多染紅細(xì)胞區(qū)分。

２．４嗜多染紅細(xì)胞

未成熟的紅細(xì)胞處于發(fā)育的中間期，仍含有核糖體，故可用選擇性核糖體染料與成熟的正染紅細(xì)胞

區(qū)分。

２．５總紅細(xì)胞

正染紅細(xì)胞和嗜多染紅細(xì)胞的總和。

３試驗(yàn)?zāi)康暮驮?/p>

哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)通過分析動(dòng)物骨髓和（或）外周血紅細(xì)胞，用于檢測受試物引起的成熟紅

細(xì)胞染色體損傷或有絲分裂裝置損傷，導(dǎo)致形成含有遲滯的染色體斷片或整條染色體的微核。這種情

況的出現(xiàn)通常是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果。此外也可能在受到紡錘體毒物的作用時(shí)，主核未能形

成代之以一組小核，此時(shí)小核比一般典型的微核稍大。

４儀器和試劑

４．１儀器

解剖器械、生物顯微鏡、載玻片等。

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２

４．２試劑

注：全部試劑除注明外均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

４．２．１小牛血清：小牛血清濾菌后放入５６℃恒溫水浴保溫１ｈ進(jìn)行滅活。通常儲(chǔ)存于４℃冰箱里。亦

可用大、小鼠血清代替。

４．２．２Ｇｉｅｍｓａ染液：稱取Ｇｉｅｍｓａ染料３．８ｇ，加入３７５ｍＬ甲醇研磨，待完全溶解后，再加入１２５ｍＬ甘

油。置３７℃恒溫箱保溫４８ｈ，期間振搖數(shù)次，取出過濾，兩周后可用。

４．２．３Ｇｉｅｍｓａ應(yīng)用液：取一份Ｇｉｅｍｓａ染液與６份磷酸鹽緩沖液混合而成?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

４．２．４１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸鹽緩沖液（ｐＨ６．８）：

磷酸二氫鉀（ＫＨ２ＰＯ４）４．５０ｇ

磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１１．８１ｇ

加蒸餾水至１０００ｍＬ

４．２．５甲醇。

５試驗(yàn)方法

５．１受試物

５．１．１受試物的配制：應(yīng)將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，

首選溶媒為水、不溶于水的受試物可使

用植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或

糊狀物等。受試物應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，有資料表明其溶液或混懸液儲(chǔ)存穩(wěn)定者除外。

５．１．２給予途徑：應(yīng)采用灌胃法。陽性對照物也可采用腹腔注射的方法。灌胃體積一般不超過

１０ｍＬ／

ｋｇ

體重，如為水溶液時(shí)，最大灌胃體積可達(dá)２０ｍＬ／

ｋｇ

體重；如為油性液體，灌胃體積應(yīng)不超過

４ｍＬ／

ｋｇ

體重；各組灌胃體積一致。

５．２實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

５．２．１動(dòng)物種、系選擇：在利用骨髓時(shí)，推薦使用小鼠或大鼠。利用外周血時(shí)，

推薦用小鼠。如果已經(jīng)

證實(shí)某品系動(dòng)物脾臟不清除有微核的嗜多染紅細(xì)胞，或?qū)σ鹑旧w結(jié)構(gòu)或數(shù)目畸變的化學(xué)物檢測有

足夠的敏感性，則此種動(dòng)物可以利用。通常用７周齡～１２周齡，體重２５ｇ～３５ｇ的小鼠或體重２００ｇ～

３００ｇ的大鼠，在試驗(yàn)開始時(shí)，

動(dòng)物體重差異應(yīng)不超過每種性別平均體重的±２０％。每組用兩種性別的

動(dòng)物至少各５只。

５．２．２動(dòng)物準(zhǔn)備：試驗(yàn)前動(dòng)物在試驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)進(jìn)行至少３ｄ～５ｄ環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。

５．２．３動(dòng)物飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)規(guī)定（

ＧＢ１４９２５、ＧＢ５７４９、

ＧＢ１４９２４．１、ＧＢ１４９２４．２、ＧＢ１４９２４．３）。每個(gè)受試物組動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)，每籠５只。試驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物喂飼基礎(chǔ)飼料，自由飲水。

５．３劑量

受試物應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組，最高劑量組原則上為動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重中毒表現(xiàn)和（或）個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡的

劑量，一般可?。保玻蹋模担?，低劑量組應(yīng)不表現(xiàn)出毒性，分別?。保矗蹋模担昂停保福蹋模担白鳛橹?、低劑量。急

性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動(dòng)物無死亡而求不出ＬＤ５０時(shí)，高劑量

組則按以下順序：

ａ）１０ｇ／

ｋｇ

體重；

ｂ）人的可能攝入量的１００倍；

ｃ）一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)，再下設(shè)中、低劑量組。另設(shè)溶媒對照組。陽性對照物可用環(huán)磷酰

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胺４０ｍｇ／

ｋｇ

體重經(jīng)口或腹腔注射（首選經(jīng)口）給予。

５．４試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)

５．４．１受試物給予

經(jīng)口灌胃。根據(jù)細(xì)胞周期和不同物質(zhì)的作用特點(diǎn)，可先做預(yù)試，確定取材時(shí)間。常用３０ｈ給受試

物法。即兩次給受試物間隔２４ｈ，第二次給受試物后６ｈ采集骨髓樣品。試驗(yàn)還可以有以下２種采樣

方式：

ａ）以受試物１次給予動(dòng)物。以適當(dāng)?shù)拈g隔采集骨髓樣品至少２次，開始不早于給予后２４ｈ，最后

不晚于給予后４８ｈ。早于給予后２４ｈ的采樣，應(yīng)說明理由。外周血采樣以適當(dāng)?shù)拈g隔至少

２次，開始不早于給予后３６ｈ，最后不晚于給予后７２ｈ。如在一個(gè)采樣時(shí)間發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，則

不需要進(jìn)一步采樣。

ｂ）每天１次給予，共２次或多次（間隔２４ｈ）給予，可在末次給予后１８ｈ～２４ｈ之間采集骨髓

１次，對外周血可在末次給予后３６ｈ～４８ｈ之間采樣１次。若選用外周血正染紅細(xì)胞的含微

核細(xì)胞率作為試驗(yàn)觀察終點(diǎn)，動(dòng)物給予的時(shí)間應(yīng)達(dá)４周以上。

５．４．２標(biāo)本制作

５．４．２．１骨髓樣品：處死后取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，

常規(guī)涂片，

或用小牛血清沖洗股骨骨髓腔制成細(xì)胞懸液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。

當(dāng)日固定后保存。將固定好的涂片放入Ｇｉｅｍｓａ應(yīng)用液中，染色１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ。立即用ｐＨ６．８的磷

酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、晾干。寫好標(biāo)簽，陰涼干燥處保存。

５．４．２．２外周血樣品：從尾靜脈或其他適當(dāng)?shù)难懿杉庵苎?/p>

血細(xì)胞立即在存活狀態(tài)染色或制備涂片

并染色。為排除與使用非ＤＮＡ染料相關(guān)的人工假象可利用ＤＮＡ特異性染料（如吖啶橙或

Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８加ＰｙｒｏｎｉｎＹ）。這種方法的好處是不會(huì)排除常用染料（如Ｇｉｅｍｓａ）的使用。

５．４．３閱片

５．４．３．１選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察。以有核細(xì)胞形態(tài)完好作為判斷制

片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。

５．４．３．２本方法系觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。用Ｇｉｅｍｓａ染色法，

嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞

呈粉紅色。典型的微核多為單個(gè)的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，直徑

通常為紅細(xì)胞的１／２０～１／５。

５．４．３．３對每個(gè)動(dòng)物的骨髓至少觀察２００個(gè)紅細(xì)胞，

對外周血至少觀察１０００個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)嗜多染紅

細(xì)胞在總紅細(xì)胞中比例，嗜多染紅細(xì)胞在總紅細(xì)胞中比例不應(yīng)低于對照值的２０％。每個(gè)動(dòng)物至少觀察

２０００個(gè)嗜多染紅細(xì)胞以計(jì)數(shù)有微核嗜多染紅細(xì)胞頻率，即含微核細(xì)胞率，以千分率表示。如一個(gè)嗜多

染紅細(xì)胞中有多個(gè)微核存在時(shí)，只按一個(gè)細(xì)胞計(jì)。

６數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價(jià)

６．１數(shù)據(jù)處理

按動(dòng)物性別分別統(tǒng)計(jì)各組含微核細(xì)胞率的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，利用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法如泊松（Ｐｏｉｓｓｏｎ）

分布或ｕ檢驗(yàn)，對受試樣品各劑量組與溶劑對照組的含微核細(xì)胞率進(jìn)行比較。

６．２結(jié)果評價(jià)

試驗(yàn)組與對照組相比，試驗(yàn)結(jié)果含微核細(xì)胞率有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，即可確

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認(rèn)為有陽性結(jié)果。若統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性，但無劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果能重復(fù)

可確定為陽性。

７試驗(yàn)報(bào)告

７．１試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、

報(bào)告編號。

７．２試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、

樣品受理日期。

７．３試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、

試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期。

７．４試驗(yàn)摘要。

７．５受試物：名稱、批號、劑型、

狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標(biāo)識(shí)）、數(shù)量、前處理方法、陽性對照

物的相關(guān)信息。

７．６實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：物種、品系、級別、

數(shù)量、周齡、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號）、

動(dòng)物檢疫、適應(yīng)情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號），飼料來源（供應(yīng)商名稱、

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)許可證號）。

７．７試驗(yàn)方法：試驗(yàn)分組、每組動(dòng)物數(shù)、

劑量選擇依據(jù)、受試物給予途徑及期限、采樣時(shí)間點(diǎn)、標(biāo)本制備

方法、每只動(dòng)物觀察的細(xì)胞數(shù)、統(tǒng)計(jì)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。

７．８試驗(yàn)結(jié)果：記錄每只動(dòng)物觀察的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)和含有微核的細(xì)胞數(shù)，

以列表方式報(bào)告不同性別

每組動(dòng)物的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)、含微核細(xì)胞率和嗜多染紅細(xì)胞在總紅細(xì)胞中的比例、劑量反應(yīng)關(guān)系、陰性

對照的歷史資料和范圍，并寫明結(jié)果的統(tǒng)計(jì)方法。