1、,第二代測序技術(shù)簡介，公司理念：毅新興業(yè)以生命科學研究為本，致力于科學技術(shù)服務(wù)，為客戶提供完美的科研平臺2007年.基因組SNPs(包括芯片、massarray)第二代大規(guī)模測序病毒包裝miRNA表達譜蛋白組血清多肽譜2DE液相色譜-質(zhì)譜（散彈槍法（代謝組核磁共振液相色譜-質(zhì)譜，自主儀器恒溫金屬浴梯度聚合酶鏈反應儀恒溫振蕩儀Squenom質(zhì)譜儀SAI質(zhì)譜儀飛行時間/飛行時間測序儀*波蘭人g . 007，試劑自主研發(fā)液體蛋白磁珠印度國家銀行試劑慢病毒核糖核酸干擾庫MicroRNA研究干細胞研究，3，內(nèi)容提綱，從桑格法到新一代測序技術(shù)第二代測序平臺介紹第二代測序技術(shù)應用宏基因組學（宏基因組學(泛基

2、因組學（盤古基因組學)，關(guān)鍵基因組學技術(shù)，1975 -南方脫氧核糖核酸雜交技術(shù)，1977 -桑格鏈終止和無極生組合，吉爾伯茨化學脫氧核糖核酸測序方法，1980 -自動原位寡核苷酸合成儀，1985年-穆利斯在塞特斯發(fā)現(xiàn)聚合酶鏈反應，1992 - Affymatrix(福多思集團(第一個基因芯片1995年- ABIs第一個自動化的脫氧核糖核酸測序儀2006年-第二代脫氧核糖核酸測序儀2007年上市，超越了單分子測序技術(shù)，桑格方法，標記引物(1)序列反應(4)序列分離(4)序列讀出，第一代自動脫氧核糖核酸測序儀，在ABI 3700上的96個毛細管上并行運行，第一代測序儀的局限性，生產(chǎn)量鏈端片段的耗時

3、分離很難產(chǎn)生基于大規(guī)模并行系統(tǒng)的電泳分離測序成本樣品處理難以小型化，需要更快更便宜的測序技術(shù)，個人基因組計劃，下一代測序的趨勢，固體表面大規(guī)模和高通量擴增群集生成（橋或聚合酶鏈反應(乳液聚合酶鏈反應（珠上片段(原位測序通過鏈延伸序列通過連接合成脫氧核糖核酸聚合酶序列通過脫氧核糖核酸連接酶大規(guī)模并行處理陣列測序技術(shù)目標，陳竺，日本血吸蟲基因組，人類全基因組測序的目標：1000美元/人2008年預測5年內(nèi)實現(xiàn)，2006年年年底，美國X大獎基金會設(shè)立了基因組執(zhí)政官X大獎，獎金高達1000萬美元。這項大獎將頒給第一個能在10天之內(nèi)，用不到100萬美元的費用，完成100個人類基因組測序的團隊。附加條件是

4、覆蓋率不小于98%，誤差不大于1/100000 bp。,下一代平臺，具有可逆熒光終止子的通用照明/索萊克斯SBS，通過焦磷酸測序的GS FLX羅氏/454生命科學SBS，具有雙堿基編碼的固體ABI/SBL阿根考特，具有堿基編碼的SBL丹納赫運動下一代測序工作流程，片段庫制備隨機對端，第二代性能，羅氏/454生命科學基因組測序儀，羅氏/454工作流程，脫氧核糖核酸文庫制備脫氧核糖核酸片段端修復不對稱連接接頭（一個生物素化(固定在鏈霉親和素包被的磁珠上變性-模板脫氧核糖核酸文庫純化，乳化擴增模板脫氧核糖核酸通過雜交固定在引物包被的捕獲珠上（每個珠上1個片段(熱型擴增（正向引物是生物素化的(富含鏈霉

5、親和素包被磁珠的擴增珠粒、羅氏/454工作流程、珠粒沉積每個微孔一個擴增珠粒隨后是酶珠粒和包裝珠粒酶珠粒硫化酶熒光素酶包裝珠粒有助于將脫氧核糖核酸珠粒保持在微孔中，焦磷酸測序4個核苷酸順序流入核苷酸摻入釋放焦磷酸(PPi)硫酸化酶將PPi轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷由熒光素酶水解產(chǎn)生光，焦磷酸測序，將PPi轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷，使用三磷酸腺苷產(chǎn)生光，去除(d)NTPs和過量的三磷酸腺苷，羅氏/454用于測定均聚物區(qū)域重復多達100個循環(huán)，后acq處理從頭測序重測序擴增子變異體分析，圖像處理化學發(fā)光事件映射到為每個孔產(chǎn)生的孔流圖堿基，羅氏/454生命科學基因組測序儀，速度快，一個測序反應耗時10個小時，獲得10

6、0余萬個讀長和4-6億個堿基對。測序讀長最長，單個序列的讀長更長，平均可達到400-500個堿基左右準確度高，讀長超過400bp時，單一讀長的準確性可以超過99%；一致性好，測序結(jié)果一致性超過99.99%；可以進行成對結(jié)束測序研究；功能強大的基因組分析工具Polonator G.007，Polonator系統(tǒng)是由喬治丘奇博士和他的研究小組發(fā)明，該系統(tǒng)使用了美國最先進試劑處理和檢測的部件，采用了最敏感的檢測設(shè)備，現(xiàn)在已發(fā)展成為一個包含多個基因組學應用領(lǐng)域的研究平臺，并且承擔了美國個人基因組計劃的個人基因組測序任務(wù)Polonator G.007最大的優(yōu)勢在于開機運行成本低和Linux開放資源軟件P

7、olonator G.007工作流程，配對末端文庫制備：配對末端文庫是將基因組脫氧核糖核酸打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用Mme1酶切，使中間接頭兩端各有30bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。乳液聚合酶鏈反應：在微反應器中加入測序模板、聚合酶鏈反應反應元件、微珠和引物，進行乳液乳液聚合酶鏈反應。微球富集和固定：聚合酶鏈反應完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。將微珠沉積在一塊玻片上，微珠上的模板經(jīng)過3修飾，可以與玻片共價結(jié)合。連接反應測序：polonator連接反應的底物是9堿基單鏈熒光探針混合物。探針的5末端分別標記了CY5、德克薩斯紅、CY3、6-FAM這

8、4種顏色的熒光染料。連接反應中，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈脫氧核糖核酸模板鏈配對，結(jié)合的探針就提供了一個熒光檢測信號，最終被儀器識別。Polonator，G.007，數(shù)據(jù)量每次運行可以得到10Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)運行時間80小時讀長30bp2，每次運行可以讀取1.2 1.3109個磁珠準確性超過99%運行成本僅為目前二代測序系統(tǒng)運行成本的60%樣品數(shù)/運行同時支持2 8道最多16個樣品測序Illumina/Solexa-基因組分析儀Illumina基因組分析儀是一種基于單分子簇的邊合成邊測序技術(shù)，它基于專有的可逆終止化學反應原理Illumina/Solexa工作流程、Solexa基因組分析儀，

9、測序通量高：每次運行后可獲得30 GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)；簡單、快速、自動化：制備樣品文庫可以在幾小時內(nèi)完成，一個星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)；脫氧核糖核酸序列的讀取長度不斷增加，當前達到100 bp單個或配對末端支持：基因組分析儀系統(tǒng)支持單個片段或配對末端文庫；每張芯片有8個通道，每個通道可單獨測序一個樣品，也可以把多個樣品混合在一起測序ABI固體文庫制備，剪切片段用接頭(A1和A2)標記到每一端，ABI固體乳液聚合酶鏈反應，乳液聚合酶鏈反應使用文庫中的脫氧核糖核酸片段在涂有一種引物的珠子(m)上進行，ABI固體珠沉積，在涂有接頭主動脈第二聲的聚苯乙烯珠上富集的擴增珠；任何含有延伸產(chǎn)物的珠粒將通過其P2末端結(jié)合聚苯乙烯珠粒。這將具有目標脫氧核糖核酸的珠子的生產(chǎn)量從30%增加到80% .富集產(chǎn)物的3個末端被修飾以允許共價連接到載玻片表面，熒光探針，通過連接的ABI固體序列，通過