1、蛋白質(zhì)與生物大分子的相互作用研究,基因的功能研究成為熱點(diǎn)，研究的對(duì)象即為基因編碼的產(chǎn)物蛋白質(zhì)，生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。 在所有生命活動(dòng)中，細(xì)胞接受外源或是內(nèi)源的信號(hào)，通過(guò)其特有的信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)，以保持其生物學(xué)特性，這其中必須涉及蛋白與蛋白、核酸的相互作用。 掌握或發(fā)明研究相互 作用的方法非常重要。,2,學(xué)習(xí)交流PPT,nucleus,cytoplasm,3,學(xué)習(xí)交流PPT,主要內(nèi)容,免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白蛋白，蛋白DNA Pulldown（親和層析）：蛋白蛋白，蛋白DNA/RNA 電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)：蛋白DNA/RNA 酵母雙雜交系統(tǒng)：蛋白（X）蛋白,4,學(xué)習(xí)交

2、流PPT,用途： 鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分析； 篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 原理： 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來(lái)。,一、免疫共沉淀（in vivo） Co-Immunoprecipitation，Co-IP,5,學(xué)習(xí)交流PPT,Co-IP工作原理示意圖,Western blot 鑒定,PAGE,質(zhì)譜,細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A”可特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段,6,學(xué)習(xí)交流PPT,Co-IP鑒定蛋白相互作用,7,學(xué)習(xí)交流PPT

3、,實(shí)驗(yàn)原則,細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件（NP40、Triton-X100等）；每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)摸索確定。 確保共沉淀的蛋白是由所加入的特異性抗體沉淀得到的，而并非其他非特異蛋白： 1、使用單克隆抗體：多抗？ 2、使用對(duì)照樣本或抗體（同型抗體）,8,學(xué)習(xí)交流PPT,Structural basis of G proteincoupled receptorG protein interactions。Nature Chem Biol, 2010, 6: 541-548（分析蛋白相互作用的位點(diǎn)）,大鼠G蛋白耦聯(lián)受體M3R,G蛋白（綠色）（藍(lán)色）（紫色）亞基,9,學(xué)習(xí)交流PPT,

4、G蛋白藕聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖,10,學(xué)習(xí)交流PPT,將不同變異體的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入cos-7細(xì)胞中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染的為對(duì)照；左圖為IP前的IB,右圖為IP后的IB，二者復(fù)合物為80kD（陽(yáng)性結(jié)果）。圖為兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的其中一次。,11,學(xué)習(xí)交流PPT,TAK-242 (Resatorvid), a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling,Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor M

5、olecules. Mol Pharmacol, 2011,79:34-41（鑒定）,分析靶蛋白與小分子化合物的作用： The immunoprecipitates were separated using SDS-PAGE immunoblotting with anti-FLAG M2 mAb or anti-HA tag mAb. analyzed using autoradiography.,12,學(xué)習(xí)交流PPT,TRAM,分析小分子化合物對(duì)蛋白相互作用的干擾,13,學(xué)習(xí)交流PPT,Screening of ClpE interaction proteins,Construct rec

6、ombinant plasmid pAE03-ClpE and transform into S. pneumoniae D39 Western blot for identification Co-Immunoprecipitation (Co-IP) transfer 1ml（OD600=0.5-0.6）cleared lysate of D39 and D39-ClpE-GFP to a 10ml beaker separately. Add 500l protein G-agarose beads (GE) , incubate for 3h at 4 on a rotating ap

7、paratus with magnetic stirrer to remove non-specifically bound proteins. Add 800l protein G-agarose beads and 2025g GFP antibody (Clontech) to the supernatant. Incubate overnight at 4 on a rotating apparatus. Wash beads five times with 1 ml PBS for 2 min each wash. Resuspend pellet in 50-80l 2 SDS s

8、ample buffer. Load 1015 l of supernatant on an SDS/polyacrylamide gel.,14,學(xué)習(xí)交流PPT,FtsW與ClpE的相互作用鑒定 A：IP前GFP多抗檢測(cè) 1.D39，2.D39（FtsW:GFP) B： IP后ClpE多抗檢測(cè) 1.rClpE，2.D39，3.D39(FtsW:GFP) C：IP前ClpE多抗檢測(cè) 1. rClpP，2.D39，3.D39(FtsW:GFP),15,學(xué)習(xí)交流PPT,優(yōu)點(diǎn)： 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。 難點(diǎn)： 需要

9、高質(zhì)量的抗體進(jìn)行IP； 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； 檢測(cè)不到弱或瞬時(shí)的相互作用。,16,學(xué)習(xí)交流PPT,應(yīng)用：分析與蛋白質(zhì)相互作用的DNA序列信息,染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immuno -precipitation, ChIP）,17,學(xué)習(xí)交流PPT,Chip-seq技術(shù),可獲得數(shù)百萬(wàn)條序列標(biāo)簽，并能把所關(guān)注的蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)精確定位到基因組上。,華大基因、上海生物芯片有限、上?？党缮镉邢薰镜?2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013,18,學(xué)習(xí)交流PPT,Genome-Wide Mapping of i

10、n Vivo Protein-DNA Interactions. Science, 2007, 316(5830): 1497-1502,Johnson等利用 ChIP-seq 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NRSF(神經(jīng)元限制性沉默因子)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了全基因組的篩查:,結(jié)果： 獲得了1946個(gè)結(jié)合位點(diǎn)； 結(jié)合位點(diǎn)的最小能分辨為50bp。,19,學(xué)習(xí)交流PPT,獲得的經(jīng)典與非經(jīng)典的神經(jīng)限制性沉默元件(NRSE)序列。,20,學(xué)習(xí)交流PPT,高質(zhì)量的ChIP-seq結(jié)果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)其為胰島發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要轉(zhuǎn)錄因子。,21,學(xué)習(xí)交流PPT,NUCKS is a pos

11、itive transcriptional regulator of insulin signaling.Cell Rep. 2014 Jun 26;7(6):1876-86,NUCKS (nuclear ubiquitous casein and cyclin-dependent kinase substrate)： 脊椎動(dòng)物中廣泛表達(dá)的一種可被多種激酶磷酸化的高磷酸化蛋白。,22,學(xué)習(xí)交流PPT,二、Pull-down實(shí)驗(yàn)（in vitro）,用途： 1.鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用 2.篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì) 原理：利用GST、HIS等標(biāo)簽蛋白將一種蛋白質(zhì)（誘餌

12、蛋白）固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件即可回收所吸附的蛋白。,23,學(xué)習(xí)交流PPT,洗脫 （2）,結(jié)合 （3）,檢測(cè) （6）,收集 （5）,洗脫 （4）,固定誘 餌蛋白 （1）,24,學(xué)習(xí)交流PPT,The Polymeric Immunoglobulin ReceptorTranslocates Pneumococci across Human Nasopharyngeal Epithelial Cells. Cell, 2000, 102:827837（鑒定）,polymeric immun

13、oglobulin receptor (pIgR) CbpA The hpIgR-mediated bacterial adherence and invasion were abolished by either insertional knockout of cbpA or antibodies against either hpIgR or CbpA.,25,學(xué)習(xí)交流PPT,methods,蛋白表達(dá)：Expression of CbpA Polypeptides (6His） Pull-down：Affinity Purification of the CbpA Binding Prot

14、eins 蛋白鑒定：Proteins in the fractions were analyzed by SDS-PAGE and IB，and N-Terminal Sequencing of the CbpA Binding Proteins,26,學(xué)習(xí)交流PPT,rCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15 (BioRad) in 0.1 M MOPS (pH 7.5) at 4； The column was sequentially washed with washing buffer； Detroit cells surfac

15、e proteins were labeled with Sulfo-NHS-LC-biotin； Cell lysates were prepared in a buffer containing protease inhibitors； Cellular debris was removed by centrifugation at 4，The supernatant was recycled through the CbpA1-affinity column for 4 h at 4； wash the column with washing buffer； the bound prot

16、eins were eluted in 300 ml fractions with 100mM glycine-HCl (pH 2.5)。,27,學(xué)習(xí)交流PPT,進(jìn)一步鑒定hplgR與CbpA結(jié)合的區(qū)段及是否需要糖基化,rCbpA were immobilized on carboxylated latex beads. Latex beads coated with CbpA polypeptides were resuspended in 100l of PBS/Mg2+/Ca2+ and 0.1% Triton X-100, and mixed with 100l of hSC（plgR

17、胞外部分）. Unbound proteins were removed by extensive washing buffer. The beads were then resuspended in SDS-PAGE loading buffer to solubilize bound proteins. Proteins were separated in SDS-PAGE gels and detected by IB.,28,學(xué)習(xí)交流PPT,CbpA與hplgR結(jié)合區(qū)段的鑒定 Vncs為S.pn的另一種膜蛋白，hSC為表達(dá)hplgR的MDCK細(xì)胞，Neo為不表達(dá)hplgR的MDCK細(xì)胞

18、。,29,學(xué)習(xí)交流PPT,Pull-down的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 靈敏、周期短 抗體質(zhì)量要求不高 可鑒定直接相互作用 缺點(diǎn)： 需要純化的蛋白 體外相互作用（假陽(yáng)性、假陰性）,E,直接結(jié)合實(shí)驗(yàn),二抗,一抗,Y,X,30,學(xué)習(xí)交流PPT,DNA/RNA Pull-down 實(shí)驗(yàn),應(yīng)用：主要用于篩選、鑒定與目的DNA或RNA片段相互作用的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子、翻譯調(diào)控因子類） 方法：與蛋白相互作用的Pull-down類似，只是固定于色譜柱或磁珠上的為標(biāo)記的DNA或RNA片段，其他步驟一樣。 優(yōu)缺點(diǎn)：相較于酵母單/三雜交，其無(wú)需構(gòu)建基因文庫(kù)、操作較簡(jiǎn)便、周期短。缺點(diǎn)與蛋白Pull-down一樣。,31,學(xué)習(xí)交

19、流PPT,32,學(xué)習(xí)交流PPT,A subset of replication proteins enhances origin recognition and lytic replication by the EB virus ZEBRA protein. PLoS Pathog. 2010, 6(8),DNA pull down 共孵育：BZKO cells were transfected with expression vectors for the indicated forms of ZEBRA together with Biotinylated oligomers contai

20、ning one of 3 regulatory regions. Pull down：The Biotinylated probes were purified from cell lysates using avidin beads. IB：The amount of ZEBRA bound to each probe and the total amount of ZEBRA present in each lysate were assessed by western blot analysis.,33,學(xué)習(xí)交流PPT,檢測(cè)DNA結(jié)合的蛋白量 A: upstream region of

21、 oriLyt BUR B: a short region of Rp BRpS C: full length Rp BRpL,34,學(xué)習(xí)交流PPT,Chip檢測(cè)（蛋白結(jié)合的DNA量）,35,學(xué)習(xí)交流PPT,36,學(xué)習(xí)交流PPT,Sreening transcription regulator by DNA pull-down,M：蛋白分子量； C1C4：CPS探針洗脫液14； K1K4：空載M-280免疫磁珠空白對(duì)照14。,37,學(xué)習(xí)交流PPT,Identity the 13 protein binding to promotor by EMSA 采用生物素標(biāo)記的啟動(dòng)子片段為探針，加入不同濃

22、度的13號(hào)蛋白，以非標(biāo)記的序列為對(duì)照，PAGE后Western blot鑒定。,38,學(xué)習(xí)交流PPT,又叫凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay） 或DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay）。 是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前被選作鑒定特定DNA或RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。 原理：DNA/RNA分子與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。,三、電泳遷移實(shí)驗(yàn) Electrophoretic Mobility Shift Assay ，EMSA),39,學(xué)習(xí)

23、交流PPT,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖 標(biāo)記的DNA片段由于與蛋白質(zhì)B結(jié)合，在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，因而呈現(xiàn)滯后的條帶。,40,學(xué)習(xí)交流PPT,41,學(xué)習(xí)交流PPT,Role of Adaptor TRIF in the MyD88-Independent Toll-Like Receptor Signaling Pathway. Masahiro Yamamoto, et al. Science 301, 640 (2003);,C：50 g/mlpoly(I:C）for the indicated periods. Nuclear extracts were prepared,and NF

24、-kB DNA binding activity was determined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) using an NF-Bspecific probe.,poly(I:C),42,學(xué)習(xí)交流PPT,建立的基礎(chǔ)：,真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子： DNA結(jié)合域： DNA binding domain, BD 轉(zhuǎn)錄激活域： Activation domain, AD,四、酵母雙雜交系統(tǒng)yeast two-hybrid system,43,學(xué)習(xí)交流PPT,酵母雙雜交技術(shù)的原理,酵母雙雜交原理圖,44,學(xué)習(xí)交流PPT,酵母雙雜交系統(tǒng)的組成

25、,與BD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait) 與AD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey或target) 帶報(bào)告基因(report gene)的宿主細(xì)胞,45,學(xué)習(xí)交流PPT,酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用,篩選、鑒定蛋白質(zhì)間的相互作用： 驗(yàn)證預(yù)測(cè)的蛋白間相互作用、鑒定突變對(duì)蛋白與蛋白結(jié)合的影響、篩選蛋白的級(jí)聯(lián)底物。 篩選、鑒定小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用： 鑒定干擾相互作用的分子、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對(duì)蛋白相互作用影響。 篩選、鑒定核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用： 尋找靶序列的結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）。,46,學(xué)習(xí)交流PPT,酵母雙雜交技術(shù)的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 不需要抗體； 可直接得到

26、相互作用蛋白的核酸序列； 胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 缺點(diǎn)： 篩選工作需要構(gòu)建基因文庫(kù)。 假陽(yáng)性結(jié)果比例較高。,47,學(xué)習(xí)交流PPT,雙報(bào)告基因,三報(bào)告基因,48,學(xué)習(xí)交流PPT,例：用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NifA（巴西固氮螺菌）相互作用的蛋白質(zhì)?？茖W(xué)通報(bào)，2005，50（6）：540-545,采用的酵母雙雜交系統(tǒng)： 酵母細(xì)胞：S. cerevisiae PJ69-4A （clontech公司） 含有3個(gè)報(bào)告基因: ade2、his3和lacZ，其中ade2基因表達(dá)最為嚴(yán)謹(jǐn)，his3和lacZ的表達(dá)相對(duì)松弛。 兩個(gè)載體pGBD（誘餌）和pGAD（靶蛋白）分別含報(bào)告基因trp和leu。,49,學(xué)習(xí)交流PPT,實(shí)

27、驗(yàn)步驟： 含nifA的誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將重組質(zhì)粒pGBD-nifA轉(zhuǎn)入釀酒酵母PJ69-4A中, 鋪于SD/-Trp, SD/-Trp/-Ade, SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp +X-Gal+BU平板上, 30培養(yǎng)25 d. pGBD-nifA轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落長(zhǎng)出, 但在X-Gal存在下不呈現(xiàn)藍(lán)色, 而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上沒(méi)有菌落長(zhǎng)出, 延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間, 仍然呈陰性結(jié)果. 這說(shuō)明誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA不能自動(dòng)激活報(bào)告基因的表達(dá), 對(duì)宿主菌也沒(méi)有毒性作用, 因此

28、pGBD-nifA可以用作誘餌質(zhì)粒.,50,學(xué)習(xí)交流PPT,巴西固氮螺菌Sp7基因文庫(kù)的構(gòu)建 提取巴西固氮螺菌Sp7的染色體DNA, 用Sau3A酶切后回收0.53 kb的DNA片段； 然后與經(jīng)BamH酶切的3個(gè)酵母雙雜合系統(tǒng)的質(zhì)粒載體pGAD1-C1, pGAD-C2及pGAD-C3分別進(jìn)行連接(以確保外源片段的正確閱讀), 則構(gòu)建成3個(gè)質(zhì)粒文庫(kù), 分別命名為YSPC1, YSCP2和YSCP3。,51,學(xué)習(xí)交流PPT,巴西固氮螺菌Sp7基因文庫(kù)的篩選和陽(yáng)性克隆的鑒定 共轉(zhuǎn)化：將基因組文庫(kù)YSPC1, YSPC2和YSPC3分別與誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,從YSPC1,

29、 YSPC2和YSPC3三個(gè)基因組文庫(kù)中共分別得到1.4106, 3105和3.5105個(gè)共轉(zhuǎn)化子. 篩選陽(yáng)性克隆：首先將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪于SD/-Leu/-Trp/-Ade選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選, 3個(gè)文庫(kù)轉(zhuǎn)化物中共有168個(gè)菌落表現(xiàn)為Ade+；再將Ade+菌落挑出點(diǎn)種于SD/-Trp/-Leu+X-Gal+BU, SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His這3種不同的平板上進(jìn)行篩選. 最后, 從3個(gè)文庫(kù)中篩選到對(duì)3個(gè)報(bào)告基因ade2, his3和lacZ均能激活的陽(yáng)性克隆109個(gè)。,52,學(xué)習(xí)交流PPT,單倍體酵母的接合,酵母的有性繁殖：a接合型和接合型, 二者接合能形成二倍體。,53,學(xué)習(xí)交流PPT,再轉(zhuǎn)化：將這109個(gè)純化后的質(zhì)粒分別與誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA再次共轉(zhuǎn)化釀酒酵母, 在選擇性平板上進(jìn)行鑒定, 結(jié)果表明, 只有11個(gè)組合可以同時(shí)激活3個(gè)