1、1,有機質(zhì)譜原理及應用,第五章：質(zhì)譜法測定分子結構(II), 大分子,2,方法：ESI和MALDI兩種電離方法。 對象：帶有官能團的可溶解高分子。 1988年，Tanaka，最早報道聚乙烯醇(PEG)， 22,000。 1992年， Danis， MALDI， 聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，30,000。 M. Karas (b) 油酸, m/z 281; (c) 亞油酸, m/z 279. 譜圖采自于AutoSpec-OATOF儀器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞氣體。,中能碰撞，400eV 特殊設計的儀器上實現(xiàn)，有較多的信息。,36,低能CID譜，M-Ht2Li+，(4,7,10,13,16,

2、19)-六烯二十二烷酸 (docosahexaenoic acid, m/z341)。,低能碰撞，400eV 信息較少，特殊情況使用。,37,5.3 糖類的質(zhì)譜分析,糖：生命體的能源供給者，傳統(tǒng)的認識。 糖的生物活性： 與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷酸脂結合成“糖復合物” (glycoconjugate)，血漿、酶、激素及細胞外膜均有含糖蛋白。糖復合物參與細胞的識別、增生、分異；維持生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和新陳代謝平衡。 寡糖和多糖具有增強免疫力，抗輻射、抗腫瘤活性，成為藥物，中藥應用，生物多糖，保健藥物，保健品。 糖結構的復雜性： 單糖的組成為CnH2nOn (n=39)，其中n=5和6最

3、為常見。每個單糖有多個手性碳原子。有鏈式結構和環(huán)式結構。 寡糖和多糖的糖鏈是由含多元羥基的環(huán)狀己糖或戊糖通過苷鍵連接而成。各羥基環(huán)上有順反異構體，各單糖分子上有五個手性碳，連接的位置和構型多種多樣。,38,糖類分析的困難性： 強極性，分離難，HPLC峰形不好。 連接方式復雜，立體化學復雜。 同系物多，糖苷鍵弱，復雜混合體系。 電離效率不高、種類有限。,16種單糖的常見結構,一、單糖及多糖的結構,39,9,葡萄糖醛酸 GlcA,10, 鼠李糖 L-吡喃鼠李糖 Rha,11, 乙酰神經(jīng)氨糖酸 NeuNAc,12,胞壁酸 2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脫氧-D-葡萄糖 Mur,14, 雞納糖

4、 6-脫氧- -D-葡萄糖,15, 泰威糖 Tyv,16, D-果糖 Fru,一個典型的雙觸角氮連接多糖的結構特征,觸角,核心區(qū),40,二、質(zhì)譜分析 電離方式： FAB：傳統(tǒng)的電離方法，主要集中于低聚寡糖的分析。 ESI：對于常規(guī)的ESI，天然多糖的電離不如肽和蛋白，納升噴霧可以改善電離效率，可以達到與肽和蛋白相當?shù)某潭取９烟堑挠H水性限制了ESI霧滴的表面活性，靈敏度低。納噴霧霧滴小，可以突破親水性的限制，靈敏度顯著升高。多糖的衍生化，減小親水性，可提高靈敏度，導致靈敏度提高的是表面活性的增加，而不是樣品的揮發(fā)性。 MALDI：低聚物糖的電離效率基本與分子量無關。由于糖的不穩(wěn)定性，MALDI電

5、離時會產(chǎn)生某些分解，尤其會產(chǎn)生亞穩(wěn)離子分解，可以用源后解離(PSD)技術測定亞穩(wěn)離子，但會使譜圖變得復雜。,多糖碎片代號表示法 非還原端用A, B, C表示。 還原端用X, Y, Z表示。 左上角標表示，環(huán)中兩根斷裂鍵所連碳原子的編號(從環(huán)上氧原子開始計數(shù)，紅色數(shù)字)，右下角的數(shù)字表示殘基的序號。,41,42,43,44,Human Genome Project,5.4 核苷酸(Oligonucleotide)的質(zhì)譜分析,Understanding The Genome To Fight The Disease Y2K Drug Design,45,500,600,700,800,900,10

6、00,1100,1200,m/z,0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,Relative Abundance,919.1,915.4,1098.6,1102.9,787.8,1107.3,922.5,784.5,686.1,790.6,817.1,1147.9,689.1,851.6,691.7,956.7,609.9,1070.7,1064.7,905.3,768.7,617.3,1153.7,1061.7,720.3,959.3,664.8,901.7,1174.3,1040.0,590.0,549.1,

7、522.1,Negative Ion ESI Of 18 mer (200 fg/uL),進樣速度： 3 uL/min 乙腈-甲醇-丙酮 (70:20:10,v/v/v, 5% TEA) 毛細管溫度: 100 C,OLIGO22 # 209-213 RT: 1.96-1.99 AV: 5 NL:1.49E5 T: - p Full ms 450.00-1200.00,46,OLIGO22,#,217-225,RT:,2.03-2.09,AV:,8,NL:,1.63E5,T:,- p Full ms 450.00-1200.00,650,700,750,800,850,900,950,1000,

8、1050,1100,m/z,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,Relative Abundance,1102.9,1098.6,918.8,915.4,787.5,784.5,689.3,686.4,611.2,-5,-6,-7,-8,Negative Ion Charge States of 18 mer,47,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,Relative Abundance,5520.0,5498.0,5541.0,5565.0,5745.0,4788.0,5972.0,5579.0,5385.0,5017.0,5221

9、.0,4908.0,5116.0,6086.0,5762.0,6206.0,4821.0,GATTCGTAGCTACGAATC Reported Avg. Mol. Wt: 5500 Monoisotopic Mass: 5497.7,Negative Ion Deconvoluted Spectra,48,Negative Ion MS2 Spectra of the - 5 and -7 Charge States,49,5.5 蛋白質(zhì)分析 一、氨基酸和小肽,小肽斷裂碎片離子定義,50,研究小肽的結構：MS/MS分析 例：一個五肽的分析 具有保護基的五肽的一級結構： BOCGlyAlaDV

10、alLeuIleOBz BOC = t-Butyloxy carbony, Bzl = benzyl.,yn = yn,51,各離子的生成途徑 MH-56+ McLafferty重排,MH-100+,52,bn系列離子,yn系列離子, yn = yn + 2,53,bn和yn系列離子生成的另一種機理,54,20種氨基酸殘基（NH-HCR-C=O）和羥胺正離子的質(zhì)量,55,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,m/z,0,100,%,998.2,942.7,893.2,848.6,808.3,616.2,

11、771.5,738.0,617.2,1060.5,999.6,1131.1,1061.8,1211.8,1132.5,1137.5,1305.0,1413.7,1541.9,1696.3,16000,17000,18000,m/z,0,100,%,16951.4,去卷積 deconvolution,20 fmole 馬心肌紅蛋白 (Horse Heart Myoglobin) ESI 質(zhì)譜圖,二、蛋白質(zhì)分析,56,原始數(shù)據(jù),去卷積 混合物：主要兩種,beta lactuglobulin,57,人血紅蛋白 MALDI-TOF 質(zhì)譜圖,58,雞蛋溶菌酶ESI質(zhì)譜圖,59,m/z1 = 895,m/

12、z2 = 945,肌紅蛋白ESI質(zhì)譜圖,60,5.6 蛋白質(zhì)組學及應用,什么是蛋白質(zhì)組？ 由基因組，細胞或組織所表達的所有蛋白質(zhì)成分。 蛋白質(zhì)組的重要性 研究基因組功能的重要途徑。 藥物目標 - 在分子水平研究健康和疾病的相關。,蛋白質(zhì)組學是一門在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的新興學科。 蛋白質(zhì)組學的終極目標是測定生物物種的所有生命活動中的所有蛋白質(zhì)。,Why蛋白質(zhì)組學?,mRNA表達水平不能預測蛋白質(zhì)表達水平 蛋白質(zhì)的修飾和加工不能從基因序列直接推導 蛋白質(zhì)組是動態(tài)的并反映生物系統(tǒng)的狀態(tài),61,蛋白質(zhì)組學面臨的挑戰(zhàn) 蛋白質(zhì)沒有可進行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。 在生物

13、處理過程中蛋白質(zhì)是高度動態(tài)變化的。 物理化學性質(zhì)的多樣性。 動態(tài)范圍的挑戰(zhàn)：相對含量超過106范圍(血清中可達1012),質(zhì)譜測量在蛋白質(zhì)組學中的作用 質(zhì)譜是肽(不是蛋白質(zhì))的一級序列分析的最普遍和最有效的工具。 質(zhì)譜是一種精確的定量工具，尤其是內(nèi)標法定量(如對同位素比的 測量)。 質(zhì)譜在確定蛋白質(zhì)高級結構時不是很有效。 質(zhì)譜對已知肽和蛋白質(zhì)重復定量分析不是很有效。,62,經(jīng)典的氨基酸序列分析方法 N端氨基酸單元的分析 最常用的有下列兩種方法： 桑格爾(Sanger F)方法：利用肽鏈N端游離氨基與2,4二硝基氟苯(DNP)發(fā)生芳香親核取代反應，而將 肽鏈上的氨基酸逐個分解。 埃德曼(Edma

14、n)方法：用異硫氰酸苯酯(PITC)和N端的 游離氨基反應，將肽鏈上的氨基酸逐個分解。 C端氨基酸單元的分析：通過羧肽酶催化水解 用特定的酶催化使含某種氨基酸的肽鍵部位水解 經(jīng)典分析方法的缺點 工作量大、測序速度慢、樣品用量大。,63,蛋白質(zhì)的二維分離,64,儀器鑒定率 肽質(zhì)量指紋譜 MALDI 50% (Peptide Mass Fingerprinter, PMF ) 多肽序列標簽 LC/MS/MS 80% (Peptide Sequence Tag, PST) 從新測序LC/MS/MS 80% (De Novo) 蛋白質(zhì)及混合物的定量分析： 同位素編碼親和標記 (Isotope-Code

15、d Affinity Tags, ICAT),蛋白質(zhì)序列研究的三個層次,65,蛋白質(zhì)組研究技術路線,樣品(組織、細胞等),凝膠圖象分析,蛋白質(zhì)鑒定,二維數(shù)據(jù)庫,酶解,HPLC-MS、MS/MS,數(shù)據(jù)庫檢索,二維凝膠電泳,酶解,肽混合物,MS、MS/MS,肽指紋譜,肽序列標簽,從新測序,66,一、肽質(zhì)量指紋譜(Peptide Mass Fingerprinter, PMF) PMF測定速度快。 PMF靈敏。 PMF需要完整和準確的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。,67,分離的酶解的蛋白質(zhì),96/384位樣品靶,數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)庫檢索,質(zhì)譜樣品的準備,MALDI質(zhì)譜分析,蛋白質(zhì)一級結構結果,PMF方法的一般流程,

16、68,洗膠/去污 脫水 減少S-S鍵 洗滌/脫水,1、In-gel 酶切/消化,Multiprobe (4x96 Well Plat) 樣品體積0.5-100 L 板上加熱和冷卻 消化板加熱 37oC 肽存儲在-4oC冷卻板 酶試劑存儲在-4oC冷卻板,修正-SH基 加入trypsin溶液 5-12小時 肽提取,2、質(zhì)譜分析樣品的制備,靈敏度： 500fmoles BSA in-gel。 移液和消化時間8小時(1x96 well plat)。 最多可進行4x96 well plat的同時消化。,基本能力,69,3、質(zhì)譜測定,設這檢索的條件，不同軟件有不同的參數(shù)和用法。,MALDI-TOF 質(zhì)譜

17、測定,4、數(shù)據(jù)庫檢索,70,樣品1,樣品2,樣品3,數(shù)據(jù)庫檢索結果： 帶*號的峰為與數(shù)據(jù)庫中的峰相匹配的峰。 樣品1：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 樣品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶 樣品3：丙糖磷酸異構酶,71,PMF 實驗，同一點上經(jīng)常是蛋白質(zhì)的混合物,Some proteins are identified with high confidence,Some proteins are identified with high confidence,Some proteins are identified with low confidence,Row data,72,And there ar

18、e still peptides unassigned to a protein,Final result,73,74,二、多肽序列標簽(Peptide Sequence Tag, PST)和肽階梯序列(Peptide Ladder Sequencing),1、肽序列標簽 蛋白質(zhì)的常見氨基酸有20 種，一般3 個氨基酸的肽段碎片將有8000種可能的排列方式4 個氨基酸將有160000種排列方式，因此即使對于不是很大的原核生物的蛋白質(zhì)組來說，一個短的序列片段也具有很高的特異性。 肽序列標簽：一個多肽的部分氨基酸序列和該肽的質(zhì)量以及該肽未測序部分的質(zhì)量。,Mann M. et al, Anal.

19、Chem., 1994,66,4390 for PST Mann M. et al, Trands in Biochem. Sci., 1996,21,494.,75,例：馬心肌紅蛋白鑒定 馬心肌紅蛋白胰酶酶切產(chǎn)物的ESI-Q-TOF肽指紋譜,76,馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(雙電荷離子)的MS/MS譜圖,肽序列標簽：,GLSDGE WQQVLNV WGK,y10,1257.8,y3, 390.3,C端,N端,WQQVLNV W,Y3,390.3,y10,1257.8,檢索結果：,77,N端 YAM IGD PTGALR C端,y10,1000.5,y7, 715.4,例： m/

20、z為691.43Da(M2+)，質(zhì)量數(shù)為1380.6Da。 MS/MS圖,肽序列標簽： 檢索結果：來自乙醇脫氫酶,715.4(DGI)1000.5,78,2、肽階梯序列(Peptide Ladder Sequencing) 梯狀測序法(ladder sequencing)：用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應氨基酸殘基，與Edman法相似。,AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,PTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -Aan PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -A

21、An,PITC + 5% PIC,ATZ(AA1) + AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,Acid (TFA),after m cycles,Further cycles (without separation),PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC- AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA4-AA5- -AAn PC-AAm- -AAn,一步MALDI-MS,階梯序列數(shù)據(jù),B. Chait et al., Science 262, 89, 1

22、993.,原理：,79,血纖維蛋白肽:,Protein ladder Sequencing Glu1fibrinopeptide B,80,81,82,可選擇性的碎裂方式： 光誘導解離(UV-193nm) 相當于高能CID。 多光子電離(IR-10.6m) 相當于低能CAD。 表面解離(SID) 相當于低能CAD。 電子捕獲解離(ECD) c和z類型碎片增強。 注：這些方法在自動化大批量實驗中并不是常規(guī)的方法。,數(shù)據(jù)庫搜索為什么會失敗 蛋白質(zhì)不在數(shù)據(jù)庫里或者不正確的搜索參數(shù)(酶特征，分類法等等)。 在數(shù)據(jù)庫里蛋白質(zhì)表達不正確(DNA核苷酸序列，基因內(nèi)區(qū)序列等等預測失敗)。 蛋白質(zhì)變性. - 變

23、性的氨基酸殘基 - N端和C端的變化：蛋氨酸的形成，序列信號變化，C鏈縮短 - 可變的序列(同族以及選擇性結合的變體) - 后修飾變化(糖基化，磷酸化等) - 不希望的化學誘導修飾(在尿素中氨甲?；? 搜索引擎不夠完善成熟。,83,三、重新測序(De novo sequence),數(shù)據(jù)庫中沒有的蛋白質(zhì)分析 樣品來源于非序列化基因組 蛋白質(zhì)經(jīng)多重高度修飾 在實際生物體中，非同尋常的酶活性 處理古生物樣本，樣品處理時肽被修飾(污染) 合成肽,重新測序的原因,譜圖的預處理 多電荷峰轉化成單電荷峰 多同位素峰轉化成擔同位素峰 簡化譜圖提高信噪比,84,譜圖處理,譜圖分析,85,16O/18O C端標記

24、 為了提高對串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解讀能力，尤其是對y和b型離子系列的辨別能力，用化學修飾方法使辨別更容易。 16O/18O C端標記：在蛋白質(zhì)酶解時，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羥基氧18O/16O的(M+2/M)同位素豐度比高于正常的峰強度，據(jù)此可以分辨出y系列離子。,給出C-端離子的唯一特征碎片離子,86,de novo 序列解釋 馬爾可夫鏈蒙特卡洛(Markov chain Monte Carlo) de novo 序列產(chǎn)生算法 貝葉斯規(guī)則(Bayesian)斷裂方式和譜圖匹配算法,Beta 牛乳糖 m/z 841.5 的MS/MS譜,87,m/z 841.5

25、 MS/MS 譜的測序結果,88,同位素親和端: ICAT試劑，重氫和正常氫的樣品。 細胞中蛋白質(zhì)被還原后，分別用含重氫和正常氫的ICAT試劑與之作用， ICAT試劑標記蛋白質(zhì)中的半胱氨酸的巰基。 將兩份蛋白質(zhì)溶液混合，然后用任何方法提取分離。 蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶切。親和色譜對肽分離。 用各種質(zhì)譜方法(MS, MS/MS等)分析。 通過同位素比例進行定量分析，通過碎片分布提供鑒定信息。,四、同位素編碼親和標記 (Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT),89,使用可分裂的ICAT試劑對蛋白質(zhì)的定量和鑒定分析,MS Data,90,混合后胰酶消化,細胞狀態(tài)一,細胞狀態(tài)

26、二,提取蛋白，還原后用ICAT的輕鏈12C標記,提取蛋白,還原后用ICAT的重鏈13C標記,典型的ICAT試劑工作流程,91,基于穩(wěn)定同位素標記定量的標記蛋白質(zhì)方法 化學標記(ICAT,N末端,以及其他殘留物末端) 優(yōu)點：一般都能適用(組織結構，細胞等) 同位素富集的生長機理(15N) 不需要任何化學干涉, 但不能應用于組織樣品，峰對之間的質(zhì)量 差可變。 新陳代謝標記（12C精氨酸） 不需要任何化學干涉，但不能應用于組織樣品。,92,五、蛋白組學方法的應用,1、生物的蛋白質(zhì)組及其數(shù)據(jù)庫 簡單生物的蛋白質(zhì)組：完全測定或大部分測定蛋白質(zhì)序列，如細菌、支原體、酵母等。 相對復雜的高等生物：線蟲、水稻、 小鼠及人類：局部或功能蛋白質(zhì)組學。 相關的數(shù)據(jù)庫的建立和完善。Langen建立了流感嗜血桿菌的雙向數(shù)據(jù)庫。 2、生物過程生理機制的研究 大腸桿菌中蛋白質(zhì)折疊的過程中新生肽段與分子伴侶的作用：首先利用免疫共沉淀得到胞質(zhì)中所有的與分子伴侶GroEL結合的肽鏈，然后用雙向電泳等方法對這些肽鏈進行鑒定。 吞噬體的蛋白組分析: 140種蛋白，其在細胞吞飲/吞噬作用途徑中的作用是以前人們所未曾預料到的。,93,3、蛋白質(zhì)的相互作用 作為細胞蛋白復合物和傳導途徑的基本要素，蛋白之間的相互作用對蛋白的功能實現(xiàn)起著關鍵的作用。 用酵母雙雜交系統(tǒng)研究線蟲生殖器的發(fā)育過