1、第五章 培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌,第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的目的、要求 和方法 第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ) 第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),培養(yǎng)基滅菌的要求和方法,1，培養(yǎng)基滅菌的定義 是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。 2，滅菌與消毒的區(qū)別 滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子 消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。,在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果： 生產(chǎn)菌和雜菌同時(shí)生長，生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)能力； 在連續(xù)發(fā)酵過程中，雜菌的生長速度有時(shí)會(huì)比生產(chǎn)菌生長得更快，結(jié)

2、果使發(fā)酵罐中以雜菌為主； 雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取精制發(fā)生困難 雜菌會(huì)降解目的產(chǎn)物； 雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品，雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品； 發(fā)酵時(shí)如污染噬菌體，可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象。,培養(yǎng)基滅菌的要求和方法,培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法,工業(yè)上具體措施 1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌； 2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理； 3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境； 4）培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過滅菌； 5）使用無污染的純粹種子。,培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法,培養(yǎng)基滅菌的要求 達(dá)到要求的無菌程度（10-3） 盡量減少營養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個(gè)基本類型的反應(yīng)引起的： 培養(yǎng)基中

3、不同營養(yǎng)成分間的相互作用； 對(duì)熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。,主要滅菌方法,滅菌的方法 化學(xué)法 化學(xué)藥品滅菌法 物理法 干熱滅菌法 熱滅菌法 射線滅菌法,主要滅菌方法,干熱滅菌法：將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150170下維持12 h后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。 在這種條件下，可使細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性、原生質(zhì)干燥，以及各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化。 灼燒：是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數(shù)對(duì)象的滅菌。,主要滅菌方法,濕熱滅菌法，多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞在60左右處理510min后即可殺死；酵母菌和真菌的孢子用80以上的溫度處理才能殺死；而細(xì)菌的芽孢一

4、般要在120下處理15min才能殺死。 巴氏消毒法（pasteurization）：目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法.,主要滅菌方法,低溫維持法：在63下保持30分鐘可進(jìn)行牛奶消毒； 間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。待滅菌的培養(yǎng)基在80100下蒸煮1560分鐘，以殺死所有營養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。,主要滅菌方法,常規(guī)加壓滅菌法：盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121（

5、壓力為1kgcm2或15磅英寸2），時(shí)間維持1520分鐘，也可采用在較低的溫度（115，即0.7kgcm2或10磅英寸2）下維持35分鐘的方法。 適合于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對(duì)培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。 連續(xù)加壓滅菌法：在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般在135140下處理515秒鐘。,主要滅菌方法,高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的影響：,主要滅菌方法,消除高溫有害影響的措施 采用特殊加熱滅菌法； 含易破壞成分的培養(yǎng)基應(yīng)與其他成分分別滅菌后再合并，或者進(jìn)行低壓滅菌； 對(duì)

6、含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先分別滅菌，再混合，避免產(chǎn)生磷酸鹽沉淀。,主要滅菌方法,濕熱滅菌的原理 每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍。當(dāng)微生物處于最低溫度以下時(shí)，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡，加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進(jìn)行的。,主要滅菌方法,濕熱滅菌相關(guān)定義 殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間稱為致死時(shí)間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時(shí)間愈短。 微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻是指某一

7、微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。,主要滅菌方法,各種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻,主要滅菌方法,培養(yǎng)基成分對(duì)滅菌的影響 油脂，糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響 培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響 培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響 培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。,主要滅菌方法,微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響 細(xì)胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越底 微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響 老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高 空氣排除情況對(duì)滅菌的

8、影響 攪拌對(duì)滅菌的影響 泡沫對(duì)滅菌的影響,主要滅菌方法,濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn) 蒸汽來源容易，操作費(fèi)用低，本身無毒； 蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底； 蒸汽有很大的潛熱； 操作方便，易管理。,濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題 將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0殺滅到可以接受的總數(shù)N（10-3），需要多高的溫度、多長的時(shí)間為合理。 滅菌溫度和時(shí)間的確定取決于： 雜菌孢子的熱滅死動(dòng)力學(xué) 反應(yīng)器的形式和操作方式 培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),二、微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)方程 實(shí)驗(yàn)證明，微生物營養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即： N：任一時(shí)刻的活

9、細(xì)菌濃度（個(gè)/L） t：時(shí)間（min） K：比熱死速率常數(shù)（min-1）,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),取邊界條件t0=0，N=N0，對(duì)（1）積分得 （2） 或 （3）,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),細(xì)菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)與營養(yǎng)細(xì)胞的有所不同。它表現(xiàn)為非對(duì)數(shù)的死亡動(dòng)力學(xué)。這可能與孢子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān)。但當(dāng)溫度超過120C時(shí)，熱阻極強(qiáng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)也接近對(duì)數(shù)死亡動(dòng)力學(xué)即符合一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),三、溫度對(duì)K的影響 微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)接近一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 它的比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表征 A：頻率因子（min-1） E：活

10、化能（J/mol） R：通用氣體常數(shù)J/（mol.k）,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),活化能E的大小對(duì)K值有重大影響。其它條件相同時(shí)， E越高，K越低，熱死速率越慢。 不同菌的孢子的熱死滅反應(yīng)E可能各不相同。,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),1/T,K（min-1）,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),反應(yīng)的E越高，lnK對(duì)T的變化率越大，即T的變化對(duì)K的影響越大,細(xì)菌孢子熱死滅反應(yīng)的E很高，而某些有效成分熱破壞反應(yīng)的E較低。 將溫度提高到一定程度，會(huì)加速細(xì)菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時(shí)間，由于有效成分的E很低，溫度的提高也會(huì)增大其破壞速度，但幅度較小。由于滅菌時(shí)間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少,第二節(jié)

11、濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),溫度上升，滅菌速率常數(shù)增加的倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分破壞的速率常數(shù)倍數(shù)。 將溫度提高到一定程度，會(huì)加速細(xì)菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時(shí)間，由于有效成分的E很低，溫度的提高只能稍微增大其破壞速度，但由于滅菌時(shí)間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少.因此，培養(yǎng)基滅菌宜采用“高溫短時(shí)間”滅菌。,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),滅菌時(shí)溫度從T1 T2時(shí)：,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),殺滅細(xì)菌芽孢的活化能 E 大于維生素等營養(yǎng)物質(zhì)破壞的活化能 E(即E E),第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),EBS=67000 4.184（J/mol） EVB=22000 4.184 （J/

12、mol） 將滅菌溫度從105C提高到127 C KVB從0.02（min-1）提高到0.06（min -1 ） KBS從0.12（min-1）提高到40.0（min -1 ）,嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子和 維生素B1的lnK-1/T圖,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死滅程度為N/N0=10-16時(shí)，滅菌溫度對(duì)維生素B1破壞的影響,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),殺菌鍋內(nèi)滅菌 培養(yǎng)基及物品滅菌所需壓強(qiáng)0,098MPa,固體培養(yǎng)基維持20-30min，液體培養(yǎng)基維持15-20min，玻璃器皿及用具維持30-60min。 種子罐、發(fā)醉罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料鑲等的空罐滅菌

13、及管道滅菌 通入蒸汽，使罐內(nèi)蒸汽壓強(qiáng)達(dá)0. 147MPa，維持45min。滅菌過程中從閥門、邊閥排出空氣，并使蒸汽達(dá)到所有死角。滅菌完畢，關(guān)閉蒸汽后，待罐內(nèi)壓力低于空氣過濾器壓力時(shí)，通人無菌空氣保持罐壓0,098MPa,空氣總過濾器和分過濾器滅菌 從過濾器上部通入蒸汽，并從上、下排氣口排氣，維持壓強(qiáng)0. 174MPa，滅菌完畢，通入壓縮空氣吹干。 種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌 從夾層通人燕汽間接加熱至80，再從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、接種管通人蒸汽直接加熱同時(shí)關(guān)閉夾層蒸汽進(jìn)口閥門，升溫到121 ，維待30min，谷氨酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌為110 ,維持l0min 發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌 從夾層或盤管進(jìn)人蒸汽，

14、間接加熱至90 ,關(guān)閉夾層蒸汽，從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、放料管三路進(jìn)蒸汽，直接加熱至121，維持10min.谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌為105 ，維持25min。,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌 一般培養(yǎng)基為130 ,維持5min。谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為115 ,維持6-8min。發(fā)酵罐需在培養(yǎng)基滅菌之前直接用蒸汽進(jìn)行空罐滅菌?？障蟛荒芰⒓蠢鋮s，先用無菌空氣保壓，待滅菌的培養(yǎng)基輸人罐內(nèi)后，才可以開冷卻系統(tǒng)進(jìn)行冷卻。 油罐(消泡劑罐)滅菌 一般條件為0. 15-0. 18MPa維持60min。 補(bǔ)料實(shí)罐滅菌 視物料性質(zhì)而定，如糖水為0.1MPa (120 )，保溫30min;淀粉料液為1

15、21維持5min。 尿素溶液滅菌 常用滅菌條件為105 ,維持5min。,第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ),第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),一、無菌的標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)微生物熱死滅方程，要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3,二、分批滅菌 1，分批滅菌的設(shè)計(jì) 在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過程,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),孢子熱死亡的規(guī)律符合,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),二、分批滅菌,因?yàn)樯郎亍⒗鋮s階段T是時(shí)間t的函數(shù)，K不是常數(shù)，所以： 式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù),第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),二、分批滅

16、菌,分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時(shí)間變化關(guān)系,T：介質(zhì)溫度（K）；T0：介質(zhì)初溫（K）；t：時(shí)間（min）； h：蒸汽相對(duì)于介質(zhì)的熱焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min） M：介質(zhì)重量(kg)；Cp：介質(zhì)比熱kJ/(kg.K)； TH：熱源溫度(K) U：總傳熱系數(shù)kJ/（m2.min.K）；q：傳熱速率（kJ/min） Cp：冷卻劑比熱；W：冷卻劑流率；TCO：冷卻劑溫度,二、分批滅菌,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),培養(yǎng)基間歇滅菌過程中應(yīng)注意的問題,溫度和壓力的關(guān)系 泡沫問題 投料過程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題 滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無菌空氣保壓,二、分批滅菌,

17、第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì),第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì),第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),連續(xù)滅菌流程圖,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),連續(xù)滅菌主要設(shè)備 套管式連消塔,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),噴嘴式連消塔,連續(xù)滅菌主要設(shè)備,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),噴射加熱器,連續(xù)滅菌主要設(shè)備,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),薄板換熱器,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),維持罐,噴淋冷卻器,連續(xù)滅菌主要設(shè)備,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個(gè)容器后，再從徘氣管中緩緩排出。容器內(nèi)的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。,第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì),在發(fā)酵過程中，往往要向發(fā)酵罐中補(bǔ)入各種不同的料液。這些料液都必需經(jīng)過滅菌。 滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補(bǔ)料速率而定。 如果補(bǔ)料量較大，而具有連續(xù)性時(shí)，則采用連續(xù)滅菌較為合適。 也有利用過濾法對(duì)另補(bǔ)料液進(jìn)行除菌。 補(bǔ)料液的分批滅菌，通常是向