1、第5節(jié) 酶的制備,Contents,1、酶的提取與分離純化技術(shù)路線,2、細胞破碎,3、酶的提取,4、酶的分離方法,Go,Go,Go,Go,5、酶的組合分離純化策略,Go,6、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶,Go,細胞結(jié)構(gòu)與酶分布,1 酶的提取、分離純化技術(shù)路線,細胞破碎,酶提取,酶分離純化,酶濃縮,酶貯存,動物、植物或微生物細胞,發(fā)酵液,離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。,酶的純化過程，約可分為三個階段： (1) 粗蛋白質(zhì) (crude protein): 采樣 均質(zhì)打破細胞 抽出全蛋白，多使用 鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。 (2) 部分純化 (par

2、tially purified): 初步的純化，使用各種 柱層析法。 (3) 均質(zhì)酶 (homogeneous): 目標(biāo)酶的進一步精制純化，可用制備式電泳 或 HPLC。,酶分離純化不同階段,本章 目錄,2 細胞破碎 許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。 1）機械破碎 2）物理破碎 3）化學(xué)破碎 4）酶解破碎,JY92-II D超聲波 細胞粉碎機,細胞破碎珠,高壓細胞破碎機,DY89-I型 電動玻璃勻漿機,機械破碎,搗碎法 研磨法 勻漿法,物理破碎,溫度差破碎法 壓力差破碎法 超聲波破碎法,化學(xué)破碎,有機溶劑： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性劑： Triton

3、、Tween,酶促破碎,自溶法 外加酶制劑法,通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。,通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。,通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎,通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎,細胞破碎方法及其原理,本章 目錄,酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。也稱為酶的抽提。 酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于

4、酸性溶劑中。 酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。,3 酶的提取,提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。,為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。,酶的主要提取方法,大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。,本章 目錄,4 酶的分離方法,1、沉淀分離,2、離心分離,3、過濾與膜分離,4、層析分離,Go,Go,Go,Go,5、電泳分

5、離,Go,6、萃取分離,Go,本章 目錄,1、沉淀分離,沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。,有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20時水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。,常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等,本節(jié) 目錄,2、離心分離,離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)

6、生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。,常速離心機又稱為低速離心機, 其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。,高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對離心力達到 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有

7、冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。,超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達 (2.512)104 r/min，相對離心力可以高達 5105 g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。,超速離心機按照其用途可以分為制備用超速離心機、分析用超速離心機和分析-制備兩用超速離心機3種,蛋白質(zhì)分子在離心時，其 分子量、分子密度、組成、形狀 等，均會影響其沉降速率，沉降係系數(shù) 即用來描述此沉降性質(zhì)； 其單位為 S (Svedberg unit)。 每一種的沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。 不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離

8、心法，在密度梯度中作分離。,本節(jié) 目錄,3、過濾與膜分離,過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。,過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。,過濾,非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì),膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì),過濾的分類及其特性 (根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ),借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜分離過程

9、中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。,膜分離,加壓膜分離,微濾 超濾 反滲透,電場膜分離,電滲析 離子交換膜電滲析,擴散膜分離,透析,根據(jù)膜材料和不同進料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。,四種常用膜分離過程的截留特性,本節(jié) 目錄,4、層析分離,層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而

10、達到分離。,層析分離方法,吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。,吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。 層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。 在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。,溶劑洗脫法 置換洗脫法 前緣洗脫法,分配層析,分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。,分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的

11、濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。,在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。,紙上層析 分配薄層層析 分配氣相層析,離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。,離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。 按活性基

12、團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。,凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。,凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按

13、照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。,常用的凝膠： 葡聚糖凝膠 瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠,親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。 酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.,常用的親和介質(zhì)及專一性配體,根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為： 共價親和層析 疏水層析 金屬離子親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析,疏水

14、層析與反相層析的基本原理,本節(jié) 目錄,5、電泳分離,帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。,電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為： 紙電泳 薄層電泳 薄膜電泳 凝膠電泳 自由電泳 等電聚焦電泳,顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。,制備式電泳通常以不含 SDS 的原態(tài) disc-PAGE 進行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。,本節(jié) 目錄,6、萃取分離,萃取分離是利用物

15、質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。,按照兩相的組成不同，萃取可以分為： 有機溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取,各種雙水相系統(tǒng),某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度,本節(jié) 目錄,5.5 酶的組合分離純化策略,設(shè)計分離純化工藝的基本要求,本章 目錄,6 酶的濃縮、干燥與結(jié)晶,濃縮與干燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶的分離純化過程中是一個重要的環(huán)節(jié)。,離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達到濃縮效果。 蒸發(fā)濃縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用真空濃縮。即在一定的真空條件下，使酶液在60以下進行濃縮。,在固體酶制劑的生產(chǎn)過程中，為了提高酶的穩(wěn)定性，便于保存、運輸和使用，一般都必須進行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 冷凍干燥 噴霧干燥 氣流干燥 吸附干燥,結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶分離純化的一種手段。它不