1、實驗二 銀耳多糖含量的測定,一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握多糖含量測定的原理和方法。,二、簡介,糖的定義： 也稱碳水化合物（carbohydrate），用Cm(H2O)n表示； 碳水化合物這個名稱并不確切，但因沿用已久，所以至今在西文中還廣泛使用。 糖是多羥醛或多羥酮及其縮聚物和某些衍生物的總稱。,糖類的主要生物學(xué)作用： 是生物體主要的能量來源。 可轉(zhuǎn)變?yōu)樯匦璧钠渌镔|(zhì)，如脂類、蛋白質(zhì)等。 可作為生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，如纖維素。 可作為細胞識別的信息分子。 其它功能。,多糖的共同特性,1分子量一般很大，在幾萬以上。在水中不能形成真溶 液，有的根本不溶于水，如纖維素。,2物理性質(zhì)：有旋光性，但無變旋

2、現(xiàn)象。無甜味。,3化學(xué)性質(zhì)：無還原性，不能成脎。,多糖（polysaccharide）,直鏈淀粉的空間結(jié)構(gòu),支鏈淀粉,與支鏈淀粉的不同在于糖原分子分支多、鏈短、結(jié)構(gòu)緊密。,糖原,糖原,糖原,纖維素,不均一多糖 透明質(zhì)酸 硫酸軟骨素 肝素 etc.,三、實驗原理,多糖在濃硫酸中水解，進一步脫水生成糖醛及其衍生物，與蒽酮（10-酮-9,19-二氫酮）反應(yīng)生成藍綠色復(fù)合物，在620nm處有最大吸收值。以標準葡萄糖溶液作標準，在620 nm波長處進行比色，可計算出總糖的含量。,（1）糖經(jīng)濃無機酸處理后，脫水生成糠醛或糠醛衍生物；,（2）糠醛和糖醛衍生物在濃無機酸的作用下，能與蒽酮化合物反應(yīng)生成有色物質(zhì)

3、。,（3）反應(yīng)液顏色的深淺，反映出糖濃度的高低。,四、儀器、試劑與藥品,試劑：0.1mg/ml的葡萄糖標準品、蒽酮試劑、蒸餾水 樣品液：0.5 mg/ml 試管、電爐、可見光分光度計、容量瓶 etc.,五、實驗操作,1、標準曲線的制作 (1) 加樣： (2) 將加好的樣品混勻，沸水浴10 min，室溫冷卻，于620 nm處比色。 (3) 以第一管為空白，進行比色。以光密度（OD值)為縱坐標，糖的含量(g)數(shù)為橫坐標，得標準曲線。,2. 樣品的準備 稱取適量樣品，先加少量的水溶解，最后定容于50 ml，至溶液濃度約為0.5 mg/ml. 3. 樣品中多糖含量的測定 分別吸取0.1、0.5 和1.

4、0 ml樣品液，用蒸餾水補足1.00 ml。加入蒽酮試劑，同標準曲線制作之操作，比色測定。根據(jù)標準曲線和樣品濃度計算含量。,六、思考題,1、根據(jù)樣品液多糖含量，計算實驗一中多糖的提取率。 2、根據(jù)蒽酮測糖原理，設(shè)計測定化合物中淀粉量的方案。,注意事項： 加樣要求準確。,實驗三 豬胃粘膜中提取胃膜素、胃酶,一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)從豬胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理和方法，了解有機溶劑分級沉淀法的應(yīng)用。,二、簡介,胃膜素 ： 功效：一種以黏蛋白為主要成分的生物活性藥物，有極強的黏附作用，可直接作用于消化道內(nèi)壁，在胃及十二指腸潰瘍面形成一層保護膜，減少胃酸對它的刺激，利于潰瘍面的愈合；另一方面有潤滑作用，

5、使進入消化道的食物易于在消化道內(nèi)移行，有利于減少某些物質(zhì)對潰瘍面的刺激。胃膜素臨床上用于胃及十二指腸潰瘍。 性質(zhì)描述: 淡黃色或淡灰色粉末，或微小顆粒。著水脹為粘漿。顯微溶狀態(tài)，略帶類蛋白胨臭。具有很強的粘附力。,胃蛋白酶： 存在于動物胃液中，以無活性的胃蛋白酶原形式，存在于胃底的主細胞中，在酸性條件下，胃蛋白酶原變化成有消化蛋白質(zhì)能力的胃蛋白酶。 在醫(yī)學(xué)上主要用于治療消化不良、食欲不振、慢性胃炎等，工業(yè)上可作水解蛋白用。 干燥的胃蛋白酶為白色或淡黃色粉末，引濕性強，易溶于水；對熱較穩(wěn)定，100 10 min不破壞。水溶液中，70 以上破壞。,三、實驗原理,胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主細

6、胞集中在胃底粘膜，呈暗紅色，直徑約10-12厘米圓塊，約100 g。 胃膜素是從豬胃粘膜經(jīng)胃蛋白酶和鹽酸消化后的上層液中，60%左右的乙醇所沉淀的部分。蛋白質(zhì)、酶等極性物質(zhì)的水溶液加入與水混溶的有機溶劑，可沉淀析出。,四、儀器、試劑與藥品,水浴鍋，攪拌器，冰箱，真空干燥，鹽酸，氯仿，丙酮，乙醇，離心機等。,四、實驗操作,1.激活提取 豬胃粘膜0.55 Kg（5只豬肚）+水約220 ml升（胃粘膜的40%），用1：1鹽酸調(diào)pH 2.5-3.0，45-50 攪拌提取3 h (在攪拌的過程中需注意不停的調(diào)節(jié)pH)。 2.脫脂分層 雙層紗布過濾，冷卻至室溫，緩慢加入約55 ml氯仿（胃粘膜的10 %）

7、，攪拌2 h，室溫靜置24 h后，放掉底層的氯仿和雜質(zhì)，上清液預(yù)冷至5以下,3. 胃膜素分離 上清液在攪拌下（同一方向，否則胃膜素會散開）緩緩加入預(yù)冷至5以下的丙酮（=0.708）至比重約0.97，撈出胃膜素，以適量的75%乙醇洗兩次，真空干燥。 4.胃酶的沉淀 母液再加丙酮至比重約0.91，有黃色沉淀產(chǎn)生，離心（4, 7000 rpm, 10 min)取沉淀，70以下真空干燥。,實驗四 胃蛋白酶活力的測定,一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握以牛血紅蛋白為底物的胃蛋白酶活力測定的原理和方法，掌握紫外分光光度計的使用。,二、實驗原理,胃蛋白酶能催化水解芳香環(huán)氨基酸連接的肽鍵。在一定條件下，可定量催化水解牛

8、血紅蛋白產(chǎn)生不被三氯醋酸（TCA）所沉淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在275nm波長處有最大吸收，以酪氨酸為對照，可以求出胃蛋白酶活力。,三、儀器、試劑與藥品,水浴鍋，紫外分光光度計，酪氨基，鹽酸，三氯醋酸，牛血紅蛋白等。,四、實驗操作,1、對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng) 105 干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液取1 mol/l鹽酸溶液65 ml，加水至1,000 ml 制成每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，搖勻，備用。 2、供試品溶液的制備：精密稱取實驗三提取的胃酶干粉40-60 mg，用上述鹽酸溶液制成每1ml 中約含 0.2 0.4U 的溶液。（稱本品（一般3500U/g以上）4

9、0-60mg，用上述鹽酸溶液定容至100 ml，再取5 ml用上述鹽酸溶液定容至50 ml，即0.04-0.06 mg/ ml）。,3、測定方法：取試管6 支，其中3 支各精密加入對照品溶液1ml ，另3 支各精密加入供試品溶液1ml ，置370.5 水浴中，保溫5 分鐘，精密加入預(yù)熱至370.5 的牛血紅蛋白試液5ml ，搖勻，并準確計時，在370.5 水浴中反應(yīng)10分鐘。立即精密加入5% 三氯醋酸溶液5ml ，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。另取試管2 支，各精密 加入血紅蛋白試液5ml ，置370.5 水浴中保溫10分鐘，再精密加入 5三氯醋酸溶 液5ml ，其中1 支加供試品溶液1ml ，另1 支加對照樣品鹽酸溶液1ml ，搖勻，過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對照品的空白對照，按照分光光度法在275nm 的波長處測定吸收度，算出平均值S 和，按