1、,7.4 酶類藥物 一、酶類藥物的原料來源 1、原料選擇 選用原料應(yīng)注意以下幾點: （1）不同酶的用料選擇：哪里有，含量高，選哪。 （2）注意不同生長發(fā)育情況及營養(yǎng)狀況, 用微生物制酶，故需測其活力來決定取酶階段。用動物器官提取酶，則與動物年齡及飼養(yǎng)條件,1,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）從原料來源是否豐富考慮； （4）從簡化提純步驟著手 （5）如用動物組織作原料，則此動物宰殺后應(yīng)立即取材。 從動物或植物中提取酶受到原料的限制，隨著酶應(yīng)用日益廣泛和需求量的增加，工業(yè)生產(chǎn)的重點已逐漸轉(zhuǎn)向微生物。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用酶，不受季節(jié)、氣候和地域的限制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)。,2,PPT學(xué)

2、習(xí)交流,二、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育 菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。與增加品種、縮短生產(chǎn)周期、改進發(fā)酵和提取工藝條件等密切相關(guān)。 優(yōu)良菌種的獲得有三條途徑： 是從自然界分離篩選： 是用物理域化學(xué)方法處理、誘變； 是用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。因此微生物的分離篩選是一切工作的基礎(chǔ)。,3,PPT學(xué)習(xí)交流,三、微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) 首先要合理選擇培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH和通氣量等。還要研究酶的分離提純技術(shù)和制備工藝。 （）原料 利用微生物生產(chǎn)酶制劑的主要原料為碳源和氮源，此外還有無機鹽、生長因素和產(chǎn)酶促進劑等。,4,PPT學(xué)習(xí)交流,如果添加少量某種物質(zhì)就能明顯增加酶的產(chǎn)量時，這類

3、物質(zhì)通稱為產(chǎn)酶促進劑。它們大多屬于酶的誘導(dǎo)物或表面活性劑。 1、固體培養(yǎng)法 固體培養(yǎng)法亦稱麩曲培養(yǎng)法 ，該法是利用麩皮或米糠為主要原料，另外視需要添加其它谷糠、豆餅等，加水拌成含水適度的半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基 。 2、液體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進行微生物的生長繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣（供氧）方法的不同，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)兩種。,5,PPT學(xué)習(xí)交流,3、影響酶產(chǎn)生的一些因素 菌種的產(chǎn)酶性能是決定發(fā)酵效果的重要因素，但是發(fā)酵工藝條件對產(chǎn)酶的影響也是十分明顯的。 （1）溫度 一般發(fā)酵溫度比種子培養(yǎng)時略高些，這樣對產(chǎn)酶有利。 （2）pH 可用糖或淀粉調(diào)節(jié)，pH低則可用氨來調(diào)節(jié)。,6,

4、PPT學(xué)習(xí)交流,（3）通氣（供氧）臨界氧濃度 。氧必須是溶解于培養(yǎng)基中的氧 。 （4）攪拌 增加液體湍流速度 ，減少氣泡周圍液膜厚度 。有利于促進細(xì)胞的新陳代謝。 （5）泡沫和消沫劑 由于培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)分子排在氣泡表面形成一層吸附膜，聚集成泡沫層之故 。 （6）添加誘導(dǎo)劑和抑制劑 誘導(dǎo)酶誘導(dǎo)酶的合成，誘導(dǎo)酶是該酶作用底物或者是其類似物。抑制劑促進酶的形成 。加入適量表面活性劑 。,7,PPT學(xué)習(xí)交流,二、酶類藥物的提取和純化 （一）生物材料的預(yù)處理 1、動物材料的預(yù)處理 （1）機械處理 用絞肉機絞，一般細(xì)胞并不破碎 。有的酶必須細(xì)胞破碎后才能有效地提取，在實驗室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。

5、 （2）反復(fù)凍融 冷到-10左右，再緩慢溶解至室溫，如此反復(fù)多次。由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個細(xì)胞破碎，從而使某些酶釋放出來。,8,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）丙酮粉 組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可減少酶的變性，同時因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成份的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中。 常用的方法是將組織糜或勻漿懸浮于0.0lmolL，pH6.5的磷酸緩沖液中，在0下一邊攪拌，一邊徐徐倒入10倍體積的-15無水丙酮內(nèi)，10min后，離心過濾取其沉淀物，反復(fù)用冷丙酮洗幾次，真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低溫下可保存數(shù)年。,9,PPT學(xué)習(xí)交

6、流,2、微生物的預(yù)處理 要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對胞內(nèi)酶則需將菌體細(xì)胞破壁，制成無細(xì)胞的懸液后再行提取。 菌體用生理鹽水洗滌除去培養(yǎng)基后，應(yīng)深凍保存。 干燥法，因為干燥常能導(dǎo)致細(xì)胞自溶，增加酶的釋放，從而在后處理中破壁不必太劇烈就能達到預(yù)期目的。 （1）常用的干燥法有： 空氣干燥 2530 真空干燥還 原劑作保護劑 冷凍干燥對較敏感的酶宜用此法。 （2）機械法：常用的方法有研磨法，組織勻漿法，超聲波法，高壓勻漿法等。,10,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）酶法處理 用得最多的是溶菌酶，如在37，pH8.0下對小球菌進行破壁處理，歷時15分鐘，即可提取核酸酶。也有用脫氧

7、核糖核酸酶處理，操作與溶菌酶同。 （二）酶的提取 1、水溶液提取法 常用稀鹽溶液或緩沖液提取。一般在低溫下操作。在酸性條件下穩(wěn)定的酶要在酸性條件下提取。一般來說，堿性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用堿性溶液提取。,11,PPT學(xué)習(xí)交流,鹽濃度一般以等滲為好，相當(dāng)于0.15molL NaCl的離子強度是最適宜于酶的提取。 2、有機溶劑提取法 某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性，最常用的有機溶劑是丁醇。 3、表面活性劑提取法 表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)含而分散在溶液中，故可用于提取結(jié)合酶。,12,PPT學(xué)習(xí)交流,4、酶制劑的工業(yè)提取法 (1)

8、發(fā)酵液的預(yù)處理及過濾 微生物發(fā)酵液的分離，過濾，發(fā)酵液中加絮凝劑或凝固劑 。絮凝劑有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸 。 (2)活性炭、脫色樹脂 。 (3)鹽析法 用得最多的是（NH4）2SO4，在常溫下不會造成酶的失活，若分級沉淀應(yīng)用得當(dāng)，雜蛋白雜質(zhì)也較少。,13,PPT學(xué)習(xí)交流,5、有機溶劑法 有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的能力為丙酮異丙醇乙醇甲醇 。工業(yè)上通常采用乙醇作為沉淀劑。 6、噴霧干燥直接制備粉末酶制劑 噴霧干燥用于干燥菌體，藥用酶常用冷凍干燥。 （三）酶的純化 評價純化工藝主要看二個指標(biāo)，一是酶比活，二是總活力回收。,14,PPT學(xué)習(xí)交流,酶在純化過程中的一些技術(shù)難點： 1、雜質(zhì)的除去 酶

9、提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等 。 （1）pH和加熱沉淀法 （2）蛋白質(zhì)表面變性法 利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可除去雜蛋白，加入氯仿和乙醇進行震蕩，可以除去雜蛋白。,15,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）選擇性變性法 利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。 甚至可用2.5%三氯乙酸處理。 （4）核酸沉淀劑法 用核酸酶，將核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于離心分離。 用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白和二氯化錳等。 （5）將酶與底物結(jié)合 酶和底物結(jié)合或競爭性抑制劑結(jié)合后，熱穩(wěn)定性大大提高，這樣就可用加熱法除去雜蛋白。,16,PPT學(xué)習(xí)交流,

10、2、脫鹽和濃縮 （1）脫鹽 脫鹽方法是透析和凝膠過濾。 （2）濃縮 酶的濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。 3、酶的結(jié)晶 把酶提純到一定純度以后（通常純度應(yīng)達50%以上），可使其結(jié)晶，酶的純度經(jīng)常有一定程度的提高。為研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)提供X射線衍射樣品。,17,PPT學(xué)習(xí)交流,（1）酶的結(jié)晶方法 酶的結(jié)晶方法主要是緩慢地改變酶蛋白的溶解度，使其略處于過飽和狀態(tài)。 鹽析法：操作要在低溫下進行，加鹽，緩沖液pH要接近酶的等電點。多數(shù)酶就可形成結(jié)晶。有時也可交替置在4冰箱中和室溫下來形成結(jié)晶。 有機溶劑法：酶液中滴加有機溶劑，有時也能使酶形成結(jié)晶。 一般要含少量無機

11、鹽的情況下，選擇使酶穩(wěn)定的pH，緩慢地滴加有機溶劑 。使用的緩沖液一般不用磷酸鹽，而用氯化物或乙酸鹽。,18,PPT學(xué)習(xí)交流, 復(fù)合結(jié)晶法：有時可以利用某些酶與有機化合物或金屬離子形成復(fù)合物或鹽的性質(zhì)來結(jié)晶。 透析平衡法 等電點法 （2）結(jié)晶條件的選擇 酶的純度：酶的純度越高，結(jié)晶越容易，長成大的單晶可能性也越大。結(jié)晶對酶有明顯的純化作用。 酶的濃度 溫度：結(jié)晶的溫度通常在4下或室溫25下，低溫條件下酶不僅溶解度低，而且不易變性。,19,PPT學(xué)習(xí)交流, 時間：結(jié)晶形成的時間,數(shù)小時到幾個月，有的甚至需要1年或更長時間。一般來說，較大而性能好的結(jié)晶是在生長慢的情況下得到的。一般希望使微晶的形成

12、快些，然后慢慢地改變沉淀條件，再使微晶慢慢長大。 pH ：調(diào)整pH可使結(jié)晶長到最佳大小，也可改變晶形。結(jié)晶溶液pH一般選擇在被結(jié)晶酶的等電點附近。 金屬離子：許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶，在酶的結(jié)晶過程中常用金屬離子有Ca2+、Zn2、Co2、Cu2、Mg2、Mn2、Ni2等。,20,PPT學(xué)習(xí)交流,晶種：不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種才能結(jié)晶， 結(jié)晶器皿處理 ：結(jié)晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用結(jié)晶母液再沖洗一次。 結(jié)晶的玻璃器皿，可用硅涂料進行表面處理，以使表面光滑且不潤濕。這樣可減少晶核數(shù)目 ，形成大的結(jié)晶。 4、酶分離和純化工作的注意事項 （1）防止酶蛋白變性 （

13、2）防止輔因子的流失 （3）防止酶被蛋白水解酶降解,21,PPT學(xué)習(xí)交流,三、 酶類藥物 （一）藥用酶類的概述 早期酶制劑主要用于治療消化道疾病，燒傷及感染引起的炎癥疾病，現(xiàn)在國內(nèi)外己廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，其制劑品種已超過700余種。 1、促進消化酶類 2、消炎酶類 3、與纖維蛋白溶解作用有關(guān)的酶類 4、抗腫瘤的酶 5、其它藥用酶,22,PPT學(xué)習(xí)交流,（二）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1） 胃蛋白酶廣泛存在于哺乳類動物的胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。 1、組成（結(jié)構(gòu)）、性質(zhì) 藥用胃蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶

14、等，為粗制的酶制劑。水溶液呈酸性，難溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。 pI為pH1.0，最適pH1.52.0?？扇苡?0乙醇和pH4的20乙醇中。 胃蛋白酶能水解大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物。,23,PPT學(xué)習(xí)交流,2、生產(chǎn)工藝 （1）工藝路線： 胃蛋白酶原鹽酸催化激活成胃蛋白酶。 常用的脫脂劑有乙醚、氯仿、四氯化碳。,24,PPT學(xué)習(xí)交流,（2）胃膜素和胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝：向經(jīng)消化、提取、脫脂、分層、濃縮及60丙酮沉淀分離胃膜素的母液中，邊攪拌邊加冷丙酮，至比重為0.91，即有淡黃色胃蛋白酶沉出，靜放過夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。 （3）結(jié)晶胃蛋白酶的制備：藥用胃蛋白酶原粉，溶于20酒精中，加

15、H2SO4調(diào)pH3.0，5靜置20h后過濾，加硫酸鎂至飽和，進行鹽析。鹽析物再在pH3.84.0的乙醇中溶解，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.82.0，即析出針狀胃蛋白酶。沉淀再溶于20% pH4的乙醇中，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8，在20放置，可得板狀或針狀結(jié)晶。,25,PPT學(xué)習(xí)交流,（三）胰蛋白酶 胰蛋白酶是從牛、羊胰臟提取、結(jié)晶的凍干制劑。易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機溶劑。在pH1.8時，短時煮沸幾乎不失活；在堿溶液中加熱則變性沉淀，Ca2+有保護和激活作用，胰蛋白酶的pI為10.1。 牛胰蛋白酶在腸激酶或自身催化下，釋放出6肽，變成有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶分子量24000

16、，由223個氨基酸殘基組成。 胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶。,26,PPT學(xué)習(xí)交流,2、生產(chǎn)工藝 （1）工藝路線：,27,PPT學(xué)習(xí)交流,（四）糜蛋白酶（Chymotrypsin，EC3.4.4.5） 胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成-糜蛋白酶。 2、生產(chǎn)工藝,28,PPT學(xué)習(xí)交流,（五）尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26） 尿激酶，是一種堿性蛋白酶。由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動物的尿中。人尿平均含量56國際單位m1。 1、組成（結(jié)構(gòu)）性質(zhì) （1）尿激酶有多種分子量形式。尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性條件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天

17、然尿激酶降解成為尿激酶。 （2）尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖維蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白質(zhì)底物，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。,29,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）尿激酶的pI為pH89，主要部分在pH8.6左右。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，凍干狀態(tài)可穩(wěn)定數(shù)年。加入1EDTA、人血白蛋白或明膠可防止酶的表面變性作用。 2、生產(chǎn)工藝 （1）工藝路線：,30,PPT學(xué)習(xí)交流,（2）工藝過程： 硅藻土吸附 ，0.02氨水加0.1molL氯化鈉洗脫。 QAESephadex層析柱 去熱原、色素。CMC濃縮 。,31,PPT學(xué)習(xí)交流,（六）溶菌酶（Lysozyme） 溶菌酶，

18、又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。它廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁、白細(xì)胞和組織（如肝、腎）細(xì)胞內(nèi)，其中以蛋清含量最豐富。 溶菌酶是一種具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗炎癥。 1、組成（結(jié)構(gòu)）和性質(zhì) 溶菌酶是一堿性球蛋白，分子中堿性氨基酸、酰氨殘基及芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。,32,PPT學(xué)習(xí)交流,溶菌酶能催化粘多糖或甲殼素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的-1，4糖苷鍵。 溶菌酶是一種罕見的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在pH5.5 加熱4h后，酶變得更活潑。低濃度的Mn（10-7molL）在中性和堿性條件下能使酶免受熱的失活作用。,33,PPT學(xué)習(xí)交流,2、生產(chǎn)工藝 （1）工藝路線,34,PPT學(xué)習(xí)交流,（七）超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase SOD） 超氧化物歧化酶是一種重要的氧自由基清除劑，作為藥用酶在美國、德國、澳大利亞等國有產(chǎn)品，此酶屬金屬酶，它催化的化學(xué)反應(yīng)是：,由于SOD能專一清除超氧陰離子自由基（O2-）；故引起國內(nèi)外生化界和醫(yī)藥界的極大關(guān)注。目前SOD臨床應(yīng)用集中在自身免疫性疾病上如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑性狼瘡、皮肌炎、肺氣腫等；也用抗輻射，抗腫瘤、治療氧中毒、心肌缺氧與缺血再灌注綜合征以及某些心血管疾病