1、牛胚胎移植簡介,一、胚胎移植的技術(shù)程序 二、胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景,一、胚胎移植的技術(shù)程序,胚胎移植的技術(shù)程序包括供體和受體的準(zhǔn)備，供體超數(shù)排卵處理和配種，胚胎的收集，胚胎的檢查，胚胎移植等 為了從供體母畜得到較多供移植的胚胎，需對供體母畜進(jìn)行超數(shù)排卵處理。同時(shí)，胚胎移植成功與否和供體、受體發(fā)情同期化成度密切相關(guān)，故需人為地控制供體和受體地發(fā)情時(shí)間，進(jìn)行同期化處理。所以，超數(shù)排卵和同期發(fā)情是進(jìn)行胚胎移植必須首先完成地兩個(gè)基本步驟。,（一） 供體和受體母畜的準(zhǔn)備,供體應(yīng)該是良種母畜，不僅應(yīng)具有較高的育種價(jià)值，而且應(yīng)該有良好的繁殖機(jī)能。經(jīng)產(chǎn)母畜應(yīng)在生殖機(jī)能恢復(fù)正常后方可作為供體。如豬和牛在分

2、娩兩個(gè)月后方可用作供體母畜，已證明對超數(shù)排卵處理發(fā)應(yīng)良好的母畜可反復(fù)用作供體。,每頭供體需準(zhǔn)備數(shù)頭受體，受體母畜可選用非良品種的個(gè)體，但應(yīng)具有良好的繁殖性能和健康狀態(tài)，體況中上等。在擁有大量母畜的情況下，可選擇與供體發(fā)情時(shí)間相同的自然發(fā)情個(gè)體作受體，供體與受體母畜發(fā)情時(shí)間前后相差不宜超過一天。由于在一般情況下難以找到足夠數(shù)量的自然發(fā)情母畜作受體，所以多采用對受體母畜進(jìn)行同期發(fā)情處理，其方法見發(fā)情控制技術(shù)。,(二)超數(shù)排卵處理,在母畜發(fā)情周期中的適當(dāng)時(shí)間，注射促性腺技術(shù)，是卵巢上有比自然生理狀態(tài)下更多的卵泡發(fā)育并排卵，這種方法稱超數(shù)排卵（Superovulation），簡稱超排。,1超排處理的意

3、義 很顯然，如果不能得到足夠數(shù)量的胚胎，就無法充分發(fā)揮胚胎移植的優(yōu)勢。所以對供體母畜進(jìn)行超排處理已成為胚胎移植技術(shù)程序中不可缺少的一個(gè)環(huán)節(jié)。 從理論上講經(jīng)超排處理后排出的卵子越多越好，而事實(shí)上如果一次排出的卵子太多，往往會因?yàn)榇傩韵偌に厥褂脛┝窟^大而影響胚胎的質(zhì)量，出現(xiàn)受精率降低，同時(shí)胚胎的收集率也降低。對于牛和羊一般認(rèn)為一次排出1015枚卵子的超排效果較為理想。,2超排處理方法 在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)期，利用外源性促性腺激素處理，增進(jìn)卵巢的生理活性，誘發(fā)許多卵泡同時(shí)發(fā)育成熟并排卵。,（1）母牛 在發(fā)情周期的第16或17天肌肉或皮下注射PMSG15002000IU。該方法是按照發(fā)情周期的規(guī)律，

4、在黃體期即將結(jié)束，卵泡期即將來臨前，順勢促進(jìn)較多的卵泡生長和成熟。這種超排方法必須和發(fā)情周期的進(jìn)程配合好，所以在時(shí)間安排上受到限制，應(yīng)用很不方便。另一種方法是在發(fā)情周期的中期，在注射促性腺激素的同時(shí)，注射或子宮灌注PGF2a 或其類似物以溶解黃體。一般是在發(fā)情周期第1013天內(nèi)進(jìn)行。具體做法是在注射PMSG后，隔日肌肉注射PGF2a或510mg，或子宮灌注PGF2a23mg。如用FSH，則連續(xù)注射45天，每天兩次，總劑量為3040mg（國產(chǎn)品400500大鼠單位），在第5次注射FSH的同時(shí)注射PGF2a。,（2）母羊 在發(fā)情周期的第1618天，一次肌注（或皮下）PMSG7501500IU，或每

5、天注射兩次FSH，連34天，出現(xiàn)發(fā)情后或配種當(dāng)日再肌注hCG500700IU。也可象母牛一樣，在發(fā)情周期中期處理，即在注射PMSG之后，隔日注射PGF2a或其類似物。如采用FSH，用量為1020mg（或200300大鼠單位），分3天6次注射，第5次同時(shí)注射PGF2a。,用PMSG超排處理牛、羊，雖然使用方便，僅需注射一次，但由于其半衰期長，會產(chǎn)生后效應(yīng)，導(dǎo)至發(fā)情期延長。因此，用PMSG進(jìn)行超排受到局限，結(jié)合注射PMSG抗血清可以消除半衰期過長的副作用。目前多采用FSH進(jìn)行超排，連續(xù)注射35天，每天2次，劑量均等或遞減，效果較好。,超排效果受動物的遺傳特性、體況、年齡，發(fā)情周期的階段、產(chǎn)后時(shí)間的

6、長短、卵巢功能、季節(jié)、激素的品質(zhì)和用量等多種因素影響。所以，不同的品種，不同的個(gè)體，對超排處理的反應(yīng)差異極大，超排效果很不穩(wěn)定。這方面迄今仍是胚胎移植中有待改進(jìn)的問題之一。,（三）供體母畜的配種,經(jīng)超排處理夫人，母畜，在表現(xiàn)發(fā)情后，應(yīng)根據(jù)育種的需要，選擇優(yōu)良公畜的精液，適時(shí)進(jìn)行人工授精。為了得到較多得發(fā)育正常的胚胎，應(yīng)使用活率高、密度大的精液，而且可適當(dāng)?shù)脑黾尤斯な芫拇螖?shù)，兩次受精間隔810個(gè)小時(shí)。,（四）胚胎的收集,胚胎的收集是利用沖卵液將胚胎由生殖道中沖出，并收集在器皿中。收集胚胎有兩種方法，即手術(shù)法和非手術(shù)法，前者可用于各種家畜胚胎的收集，后者僅適用于牛、馬等大家畜，且只能在胚胎進(jìn)入子

7、宮角后收集。,收集胚胎時(shí)應(yīng)考慮配種時(shí)間、排卵的大致時(shí)間、胚胎運(yùn)行的速度和發(fā)育階段等因素。只有這樣才能順利地完成胚胎的收集過程，并得到較高的胚胎回收率。各種家畜授精后胚胎發(fā)育的速度和運(yùn)行情況見表。,胚胎收集的時(shí)間不應(yīng)該早于排卵后的第一天，最早應(yīng)在受精卵完成第一次卵裂之后，否則不易辨別卵子是否受精。收集時(shí)間一般在配種后的38天，牛最好是在配種后的68天，即胚胎發(fā)育至桑椹胚或者早期囊胚，以便非手術(shù)法收集和移植。,1手術(shù)法收集胚胎 根據(jù)畜種的不同及外科手術(shù)的要求，在腹中線或腹側(cè)作一切口，先將一側(cè)輸卵管及子宮角移出腹腔，用注射器吸取沖卵液注入輸卵管或子宮角內(nèi)進(jìn)行沖洗，并觀察卵巢上的排卵情況。然后將該側(cè)送

8、回腹腔，并移出另一側(cè)，用同樣方法進(jìn)行沖洗。,手術(shù)法沖洗胚胎有以下幾種方式（圖102）。一種方式是用注射器的磨鈍針頭刺入子宮角頂端，注入沖洗液，然后再輸卵管的傘部接取沖卵液，這種方式適用于牛、羊、兔等。另一種方式?jīng)_洗的方向與此相反，即由傘部注入沖洗液，在子宮角上端接取。豬和馬的子宮角與輸卵管的接合部有一活塞結(jié)構(gòu)，用第一種方式，沖洗液不易通過，因此多采用第二種方式。上述兩種方式是當(dāng)胚胎還處于輸卵管時(shí)采用。當(dāng)確認(rèn)所有的胚胎都已進(jìn)入子宮角內(nèi)時(shí)，可采用沖洗子宮角的方式，即從子宮角上端注入沖卵液，由基部接取，或者相反。這種方式適合于各種家畜。沖卵液用量以子宮角容積大小而異。沖卵操作，要求迅速準(zhǔn)確，以防止對

9、傷口、生殖器官和沖卵液的污染，力求避免給動物帶來刺激和對生殖器管造成損傷。一般來說，術(shù)后生殖器官容易發(fā)生不同程度的粘聯(lián)，嚴(yán)重時(shí)會造成不孕，這是手術(shù)法收集胚胎最大的缺點(diǎn)。沖洗之后，應(yīng)立即縫合傷口，母畜應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并隨時(shí)觀察其傷口的愈合情況。,2非手術(shù)法收集胚胎 牛、馬也可采用非手術(shù)法收集胚胎，由于它比手術(shù)法簡單易行，而且對生殖器官的傷害程度較小，因此在生產(chǎn)中較多采用此法,牛的非手術(shù)法收集胚胎可利用雙通式或三通式導(dǎo)管沖卵器，其差別在于雙通式采卵器沖卵液注入和流出是經(jīng)同一管道完成的，而三通式采卵器沖卵液的注入和流出是經(jīng)過兩個(gè)不同的管道完成的。無論是雙通式還是三通式，其外管前端均連接一氣囊。當(dāng)沖卵器插

10、入子宮角內(nèi)時(shí)，充氣沖卵液流入子宮體并沿著子宮頸口流出。每側(cè)子宮角需沖卵液100500ml。沖卵液的導(dǎo)出應(yīng)順暢迅速，并盡可能將沖卵液全部收回。為此，沖卵時(shí)最好用手在直腸內(nèi)將子宮角提高并略加按壓，以利于沖卵液流出。胚胎的回收率與沖卵液回收的完全程度呈正相關(guān)。,應(yīng)用非手術(shù)法收集胚胎時(shí)，只有當(dāng)胚胎都進(jìn)入子宮角后方可進(jìn)行。顯然，這種方法無法收集停留在輸卵管內(nèi)的胚胎，因此，用非手術(shù)法收集牛、馬的胚胎時(shí)，一般在配種后的68天進(jìn)行。,收集胚胎的沖洗液有多種，主要有杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS），布林斯特氏液，合成輸卵管液（SOF），惠屯氏液，Hams F110以及TCM199，尤以D-PBS最常用。它們除含有

11、多種鹽外，還含有多種有機(jī)成分，不但可用于胚胎收集，還可用于胚胎體外培養(yǎng)，冷凍保存及解凍等。,收集胚胎的沖洗液可不含牛血清白蛋白，培養(yǎng)和保存時(shí)則需加入，或以胎犢血清代替。血清白蛋白的含量一般為0.31，犢牛血清需在56時(shí)持續(xù)滅活30分鐘，沖卵液、培養(yǎng)液中血清的含量一半分別為5、1020。,（五）胚胎的檢查,胚胎的檢查包括兩個(gè)過程，一是檢胚，二是胚胎鑒定。檢胚時(shí)須將收集到的沖卵液靜置10分鐘，等胚胎下沉后移去上層液，直接活吸取底部液體，然后置于實(shí)體顯微鏡下檢胚。檢到的胚胎應(yīng)及時(shí)移入含有20犢牛血清的PBS培養(yǎng)液中進(jìn)行鑒定。胚胎鑒定的方法有以下幾種。,1形態(tài)學(xué)法 這是目前鑒定哺乳動物胚胎最廣泛，最實(shí)

12、用的方法。一般是在3060倍的實(shí)體顯微鏡下或120160倍的生物顯微鏡下對胚胎進(jìn)行評定，評定的內(nèi)容包括：（1）卵子是否受精，未受精卵的特點(diǎn)是透明帶內(nèi)有分布均勻的顆粒，無卵裂球；（2）透明帶形狀，厚度，有無破損等；（3）卵裂球的致密程度，卵黃周隙內(nèi)是否有游離細(xì)胞或細(xì)胞碎片，細(xì)胞大小是否有差異；（4）胚胎的發(fā)育程度是否與胚齡一致，胚胎的透明度，胚胎的可見結(jié)構(gòu)是否完正等。,根據(jù)胚胎的形態(tài)特征將胚胎分為A（優(yōu)）、B（良）、C（中）、D（劣）四個(gè)等級。,2熒光活體染色法 將二醋酸熒光素（FDA）加入待鑒定的胚胎中，培養(yǎng)36分鐘，活胚胎顯示熒光，死胚胎無熒光。這種方法比較簡單，而且可驗(yàn)證上述形態(tài)學(xué)對胚胎做

13、出的分類結(jié)果，因此，在生產(chǎn)上應(yīng)用的也比較多。,3測定代謝活性法 通過測定胚胎的代謝活性，鑒定胚胎的活力。其方法是將待鑒定的胚胎放入含有葡萄糖的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1小時(shí)后，測定葡萄糖的消耗量，每培養(yǎng)1小時(shí)消耗葡萄糖25ug以上者為活胚胎。應(yīng)該注意的是在檢胚及進(jìn)行胚胎分類時(shí)，胚胎均應(yīng)保持在不低于25的環(huán)境溫度下。,（六）胚胎的移植,胚胎移植也有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式，前者適用于各種家畜，后者僅適用于牛、馬等大家畜。用作受體的母畜應(yīng)具有明顯的發(fā)情癥狀，發(fā)情時(shí)間應(yīng)與供體母畜一致。,1手術(shù)移植法 受體母畜應(yīng)和供體母畜同時(shí)做好術(shù)前準(zhǔn)備，在進(jìn)行胚胎檢查的同時(shí)或之后，立即在受體腹部作一切口，找到排卵側(cè)的卵巢并觀

14、察黃體發(fā)育情況，根據(jù)胚胎的發(fā)育階段，用注射器或移植管將胚胎注入排卵卵巢同側(cè)子宮角上端或輸卵腹部內(nèi)，然后迅速復(fù)位、縫合。,2非手術(shù)移植法 牛的非手術(shù)移植法是將一只手伸入直腸，先檢查黃體位于那一側(cè)卵巢及其發(fā)育情況，然后類似于人工授精技術(shù)，用手把握住子宮頸，另一只手將胚胎移植搶插入與黃體同側(cè)的子宮角內(nèi)，注入胚胎。所移胚胎僅限于來自供體子宮角的胚胎。 移植時(shí)動作要迅速準(zhǔn)確，避免對組織造成損傷。黃體發(fā)育不良的母畜最好不用作受體，以免影響受胎率。,（七）供體和受體術(shù)后觀察,對術(shù)后的受體和供體不但要注意觀察它們的健康狀況，同時(shí)要留心觀察它們在預(yù)定的時(shí)間是否發(fā)情。供體在下一次發(fā)情時(shí)可照常配種，或經(jīng)過兩、三個(gè)月

15、再重復(fù)當(dāng)供體。供體母畜的正常發(fā)情是我們所希望的，而受體母畜則相反，術(shù)后發(fā)情則說明未受胎的原因可能是胚胎移植死亡或在移植過程中丟失，也可能是移植的胚胎本來就有缺陷，如果未發(fā)情則需進(jìn)一步觀察，在適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行妊娠檢查。如確已妊娠，則需加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。,二、胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景,（一）胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用,人工受精,胚胎分割 胚胎分割的目的有兩個(gè)，一個(gè)是進(jìn)行性別鑒別，另一個(gè)是增加胚胎利用率，降低生產(chǎn)成本。這一技術(shù)的關(guān)鍵就是保護(hù)液選擇和切割技術(shù)。我國在這一領(lǐng)域的研究和應(yīng)用與世界先進(jìn)水平接近。據(jù)報(bào)道，內(nèi)蒙古采用鮮胚切割的牛胚發(fā)育率為80%，凍胚為56.9%，這項(xiàng)技術(shù)的研究與應(yīng)用潛力較大。,胚胎性別鑒定

16、 過去采用細(xì)胞遺傳學(xué)、特異性抗原檢測，目前采用Y-特異性DNA探針技術(shù)，在國內(nèi)外已開始應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)要求一定的設(shè)備和分子生物學(xué)技術(shù)，但準(zhǔn)確度高，據(jù)中國農(nóng)科院畜牧所羅應(yīng)榮等報(bào)道，應(yīng)用PCR試劑盒鑒定性別準(zhǔn)確率為97.7%，切割取樣后的凍胚成功率為45.4%，冷凍胚胎切割取樣后移植成功率為38%，略低于全胚成功率，如何縮小這個(gè)差距，也是需研究改進(jìn)的。,胚胎移植提高雙胎率是肉牛生產(chǎn)的重要技術(shù) 英國的Powson等人給僅存一個(gè)黃體的子宮角中放入一個(gè)受精卵，雙胎率達(dá)到73%。據(jù)河北省胚胎移植研究中心桑潤之等報(bào)道，把7日齡的凍胚移植到兩側(cè)子宮角受孕率61.5%，雙胎率50%，移植到一側(cè)受孕率52.2%，雙

17、胎率41.7%6，在這一方面的研究我國與國外還有一定差距。,盡管胚移技術(shù)在國外已經(jīng)是一項(xiàng)比較成熟的技術(shù)，但在國內(nèi)，由于技術(shù)、管理上的問題，推廣面積小，如內(nèi)蒙古19931997年完成移植肉牛657例，河北省移植受體母牛122頭，還是推廣較好的省份。從胚胎生產(chǎn)角度來看，依靠進(jìn)口胚胎，勢必造成成本太大，不利于推廣，國產(chǎn)胚胎因技術(shù)、設(shè)備落后，質(zhì)量不移定，也沒有形成規(guī)模，但成本較低。從胚胎移植技術(shù)來看，由于牛的品種個(gè)體一致性差，在超排藥物種類選擇，尤其是適宜劑量等方面掌握的不好。缺乏足夠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，積累的經(jīng)驗(yàn)還不夠。同期發(fā)情處理、最佳移植條件的確定與檢測、性別鑒定技術(shù)的實(shí)用化程度等方面都還沒有形成配套技

18、術(shù)，熟練影響胚胎移植技術(shù)推廣的重要原因。,胚胎移植目前存在的主要問題,理論上講胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用可使母畜的繁殖力比在自然狀況下提高很多倍，但從目前的技術(shù)水平和所取得的成績看，胚胎移植的效果比理論上的預(yù)期值低很多。例如牛的胚胎移植，每頭供體經(jīng)一次超排處理后移植，最后產(chǎn)犢一般是24頭。胚胎移植目前存在的主要問題有以下幾個(gè)方面。,我國奶牛平均產(chǎn)奶量為1546kg，而世界奶牛平均產(chǎn)奶量為2010kg，發(fā)達(dá)國家平均為60007000kg，我國肉牛日增重平均1.2kg，而發(fā)達(dá)國家平均為1.82.4kg。我省黃牛改良工作自70年代以來，大力推廣黃牛凍配改良，取得了很大成效，但是應(yīng)用新的繁殖生物技術(shù)胚胎移植技

19、術(shù)，擴(kuò)繁引進(jìn)的良種肉牛奶牛的群體，加速提高我省肉牛、奶牛的生產(chǎn)水平，提高養(yǎng)牛的經(jīng)濟(jì)效益已經(jīng)顯得十分迫切和需要，如何解決胚胎移植的技術(shù)問題，以推動這項(xiàng)技術(shù)在黃牛改良上的應(yīng)用，尚需在以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：牛的超數(shù)排卵、同期發(fā)情及沖卵技術(shù)的改進(jìn)研究，以提高采集有效受精卵的數(shù)量；非手術(shù)法胚胎移植試驗(yàn)與技術(shù)改進(jìn)，以提高非手術(shù)法胚胎移植的受胎率。胚胎分割技術(shù)的試驗(yàn)與應(yīng)用，以提高胚胎的利用率，降低生產(chǎn)成本。進(jìn)行胚胎性別的鑒定，有目的的控制公母群體數(shù)量。胚胎移植雙卵技術(shù)試驗(yàn)，以提高肉牛生產(chǎn)效益。,1超排效果不夠穩(wěn)定 利用外援性促性腺激素刺激多排卵并不能每次都得到預(yù)期效果，不同的個(gè)體對超排處理的反應(yīng)差異極大，排卵率很不穩(wěn)定，有的個(gè)體甚至對超