1、生物柴油廢物利用費(fèi)氏丙酸桿菌亞種.薛氏（Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii）親本株和其滲透敏感突變體在有氧條件下提高海藻糖產(chǎn)量,From:J Ind Microbiol Biotechnol (2012) 39:11531160 翻譯者：趙靜 學(xué)號(hào)：Z1318026,引言 材料和方法 結(jié)果與討論 結(jié)論,引言,海藻糖是一種非還原性，非常穩(wěn)定的包含由a，a-1，1-葡萄糖苷鍵鏈接的兩個(gè)a-葡萄糖單位的二聚糖。海藻糖有溫和的甜味，高溶解度和低吸濕性。在一些食品加工和儲(chǔ)存中它也很穩(wěn)定，從而能防止美拉德反應(yīng)；因此，它被應(yīng)用于干燥食品（奶粉，

2、果汁） ，冷凍食品，糖果（蛋糕，烤糖果，果醬，奶油，甜果醬），飲料，發(fā)酵食品（面包，酸奶），冰淇淋，醬油，甜味劑和調(diào)味品。 海藻糖結(jié)構(gòu)式：,它也可以在食用的食物中用來作為食品添加劑。海藻糖也被報(bào)告還有保健品價(jià)值。它的甜度為蔗糖的一半，提供持續(xù)的能量。另?yè)?jù)報(bào)道海藻糖在乳酸乳球菌中作為壓力保護(hù)劑起作用。 如果海藻糖能夠?qū)崿F(xiàn)經(jīng)濟(jì)化，它在食品領(lǐng)域和其他領(lǐng)域中的新興應(yīng)用也能夠?qū)崿F(xiàn)。用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生產(chǎn)海藻糖的常規(guī)方法具有相對(duì)低的產(chǎn)量，已經(jīng)被酶轉(zhuǎn)化過程取代 。與酶的方法相比，各種微生物為基礎(chǔ)的過程在利用農(nóng)業(yè)或工業(yè)的廢棄物為底物用于生產(chǎn)有價(jià)值的代謝產(chǎn)物具有優(yōu)勢(shì)

3、。因此，利用像粗甘油的生物柴油廢物，微生物替代目前使用酶法工藝生產(chǎn)海藻糖滴度較高，在經(jīng)濟(jì)上和環(huán)境保護(hù)方面有優(yōu)勢(shì)。生物柴油制造行業(yè)生產(chǎn)的大量的生物柴油廢物帶來了主要的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。同樣，粗甘油通過微生物轉(zhuǎn)化成增值產(chǎn)品是對(duì)廢棄物的另一種利用，這似乎是在經(jīng)濟(jì)上更可行。,丙酸桿菌是革蘭氏陽(yáng)性，非芽胞，不能運(yùn)動(dòng)的多形性桿菌。它們?cè)?0和中性pH值條件下生長(zhǎng)最佳 。眾所周知的是它具有多種益生菌特性，被視為安全的食品微生物。丙酸桿菌被稱為是厭氧的，但據(jù)報(bào)道，他們對(duì)有氧條件也不是很敏感 。另?yè)?jù)報(bào)道，費(fèi)氏丙酸桿菌在有氧條件下生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致生物量的增加和有機(jī)酸的形成物曲線的變化 。 在本研究中，其中費(fèi)氏丙酸桿菌亞種.薛氏

4、（Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii）NCIM5137的滲透敏感突變體和親本株用純甘油和粗甘油作為碳源在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)(在搖瓶中以200rpm轉(zhuǎn)速和生物反應(yīng)器中30空氣飽和度)海藻糖含量和生物量增長(zhǎng)曲線在固定的時(shí)間間隔內(nèi)被測(cè)定。丙酸和乳酸等有機(jī)酸的最終產(chǎn)率也被估計(jì)。,材料和方法,微生物和培養(yǎng)基成分 突變體的化學(xué)誘變，篩選和分離 搖瓶實(shí)驗(yàn) 批式反應(yīng)器實(shí)驗(yàn) 粗甘油或著制備及預(yù)處理生物柴油廢物 海藻糖的提取和分析 有機(jī)酸的HPLC分析 生物量定量 底物分析,結(jié)果與討論,1）在P. shermanii NCIM5137搖瓶實(shí)驗(yàn)中利用純

5、甘油和粗甘油生產(chǎn)海藻糖,圖1用P. shermanii NCIM5137在純甘油和粗甘油介質(zhì)中的生物量的產(chǎn)量和海藻糖滴度 (Fig. 1 Trehalose titre and biomass production in media with pure and crude glycerol in P. shermanii NCIM 5137)（在搖瓶培養(yǎng)條件下，有氧條件下）,因此，本研究表明，在有氧條件下，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，這導(dǎo)致海藻糖相對(duì)于生物量，有一個(gè)較低的產(chǎn)量。因此，可以得出結(jié)論，盡管海藻糖相對(duì)于生物量的產(chǎn)量(YTx)減少了兩倍（表3） ，但是在有氧的條件下導(dǎo)致最終的生物量濃度高20倍，

6、整體海藻糖滴定度增加2.3倍（表1） 。不幸的是，獲得的海藻糖滴度并不理想，因此努力在有氧條件下使用已開發(fā)的滲透敏感的突變體，以提高海藻糖的滴度。,表1在用P. shermanii親本株條件下比較用純甘油與粗甘油得到的的海藻糖滴度，丙酸和乳酸酸產(chǎn)量(Table 1 Comparison of trehalose titre and propionic acid and lactic acid yields in parent strain of P. shermanii with pure and crude glycerol),海藻糖滴度：粗甘油為2.3倍純甘油,2）利用滲透敏感突變體P.

7、shermanii NCIM513在搖瓶中使用純甘油和粗甘油生產(chǎn)海藻糖,圖2用P. shermanii NCIM5137滲透敏感突變體在純甘油和粗甘油介質(zhì)中的生物量的產(chǎn)量和海藻糖滴度 Fig.2 Trehalose titre and biomass growth in media with pure and crude glycerol in osmotically sensitive mutant of P. shermanii NCIM 5137（在搖瓶培養(yǎng)條件下，有氧條件下）,因此，在類似的實(shí)驗(yàn)條件下用粗甘油得到的海藻糖的滴度，突變株與親本株相比高3.6倍。,表2在用P. sherma

8、nii滲透敏感突變株條件下比較用純甘油與粗甘油得到的的海藻糖滴度，丙酸和乳酸酸產(chǎn)量 Table 2 Comparison of trehalose titre and propionic acid and lactic acid yields in mutant strain of P. shermanii with pure and crude glycerol,親本株為361 11mg/l(表1) 突變株為130322 mg/l(表2),因此，利用突變體用粗甘油介質(zhì)可以得出在搖瓶條件下比在靜態(tài)燒瓶中海藻糖相對(duì)于生物量的產(chǎn)量（Ytx）下降了1.74倍的結(jié)論（表3)。生物量濃度利用突變體在有氧

9、培養(yǎng)條件下增加了25倍，海藻糖滴度增加了3.6倍。因此，我們要采取措施在不影響海藻糖相對(duì)于底物消耗的產(chǎn)量(Yts)的條件下以確保較高的海藻糖滴度提高3.6倍。這些結(jié)果促使我們用粗甘油在控制式批式反應(yīng)器中研究海藻糖的生產(chǎn)。,表3 P. shermanii NCIM5137的突變株和親本株用粗甘油（20克/升）在需氧和厭氧條件下），比較海藻糖相對(duì)于生物量的產(chǎn)量（Ytx），海藻糖相對(duì)于底物消耗（Yts）和海藻糖滴定度（全部海藻糖） Table 3 Comparison of trehalose yield with respect to biomass ( Ytx) and substrate co

10、nsumed ( Yts), trehalose titre (absolute trehalose) in mutant and parent strain of P. shermanii NCIM 5137 with crude glycerol (20 g/l) in aerobic and anaerobic conditions（在靜態(tài)燒瓶中是厭氧狀態(tài)，在搖瓶中是有氧狀態(tài)）,大約是4倍,大約是4倍,3）利用滲透敏感突變體P. shermanii NCIM5137在批式反應(yīng)器中研究實(shí)現(xiàn)較高的海藻糖滴度,圖3 (在批式反應(yīng)器條件下利用粗甘油介質(zhì)和P. shermanii NCIM5137

11、的滲透敏感突變，海藻糖滴度和增加的生物量) Fig. 3 Trehalose titre and biomass growth in media with crude glycerol in osmotically sensitive mutant of P. shermanii NCIM 5137 under batch reactor conditions,結(jié)論,本研究中描述了一種新穎的方法，使用食品微生物Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii的滲透敏感突變體把生物柴油廢物中的粗甘油轉(zhuǎn)化為保健產(chǎn)品海藻糖。海藻糖滴度從158毫克/升

12、提高到1.56克/升，前者利用親本株使用純甘油在搖瓶培養(yǎng)中，后者利用突變株使用粗甘油在批式反應(yīng)器條件下。因此，利用廢物在安全的食品微生物的幫助下，一個(gè)高效，不破壞環(huán)境的海藻糖的生產(chǎn)工藝被開發(fā)。通過有氧培養(yǎng)條件改善海藻糖滴度的方法似乎是有效的，它可以實(shí)現(xiàn)更高生產(chǎn)率并可以得到進(jìn)一步研究。在相似的實(shí)驗(yàn)條件下，海藻糖相對(duì)于生物量的產(chǎn)量(Ytx)使用突變體與使用親本株相比高出四倍(表3)。產(chǎn)量的明顯提高，導(dǎo)致了海藻糖滴度使用突變株比使用親本株高出四倍 。,搖瓶培養(yǎng)中，用粗甘油介質(zhì)，得到的海藻糖滴度：親本株361mg/l；突變株1.3g/l,謝謝！,微生物和培養(yǎng)基成分,菌株和培養(yǎng)基和以前描述的那些是相同的

13、。薛氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )NCIM5137取自于NCL Pune, India。對(duì)于海藻糖的生產(chǎn)，使用的培養(yǎng)基與其他地方報(bào)道的是相同 ，包括胰蛋白胨（20克/升），蛋白胨（20克/升），酵母提取物（1克/升），磷酸氫二鉀（0.25克/升），維生素溶液（20毫升/升）和碳源（20克/升）。維生素溶液包括生物素（1.1毫克/升），葉酸（1.1毫克/升），對(duì)氨基苯甲酸（110毫克/分升），核黃素（110毫克/分升），吡哆醇（220毫克/升），硫胺素（220毫克/升）和煙酰胺（220毫克/升）。,突變體的化學(xué)誘變，篩選和分離,滲透敏感突變體的分

14、離和篩選之前被報(bào)道過。簡(jiǎn)言之， 25毫升液體培養(yǎng)基是指數(shù)增長(zhǎng)階段的P. Shermanii NCIM 5137 。離心分離沉淀得到的細(xì)菌細(xì)胞懸浮在5 mM磷酸鹽緩沖液的pH值為7.1 。8EMS溶于5mM磷酸鹽緩沖液（pH7 ）對(duì)其進(jìn)行化學(xué)誘變 。細(xì)菌細(xì)胞懸浮在8 EMS的溶液中 ，并在37 下培養(yǎng)45分鐘，之后將細(xì)胞沉淀用硫代硫酸鈉洗滌三次，抵銷誘變劑的效果。進(jìn)一步不同稀釋度的細(xì)菌細(xì)胞（ 10-1-10 - 8 ）在以葡萄糖作為碳源瓊脂平板上培養(yǎng)。從瓊脂平板上進(jìn)一步選擇單菌落，接種單菌落的瓊脂平板包含葡萄糖作為碳源，1，2 ，3，4和8 的NaCl ，0.01和0.05 SDS和沒有SDS和

15、NaCl的瓊脂平板。在NaCl板和SDS板上的菌落沒有增長(zhǎng)或微弱增長(zhǎng)，被選擇生產(chǎn)海藻糖。單菌落同時(shí)涂布含有0和3 NaCl的瓊脂平板上的反復(fù)檢查其穩(wěn)定性。經(jīng)過約50反復(fù)涂布，在本研究中任何菌落無(wú)法在3 氯化鈉生長(zhǎng)，但能夠在0的NaCl生長(zhǎng)。因此，突變體關(guān)于滲透敏感性得到證明。,搖瓶實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)物包含100毫升的液體介質(zhì)放于500ml培養(yǎng)瓶中。全部培養(yǎng)瓶接種新鮮的培養(yǎng)基和菌落并在30，200 rpm條件下培養(yǎng)。通過分光光度法測(cè)量光密度監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)。培養(yǎng)液的光密度測(cè)量是培養(yǎng)液20,000g，4下離心分離10分鐘，所得沉淀被洗滌并重新懸浮在等滲溶液（0.85NaCl）中，然后在600 nm條件下通過光密度

16、測(cè)量。而且，在一定時(shí)間間隔內(nèi)收集細(xì)胞培養(yǎng)樣品，并迅速在20,000g，4下離心15分鐘;上清液（無(wú)細(xì)胞肉湯）被儲(chǔ)存在-20條件下，被用于底物濃度的分析，然而洗滌后的細(xì)胞沉淀物儲(chǔ)存在冰箱（-80），用于進(jìn)一步分析海藻糖含量。,批式反應(yīng)器實(shí)驗(yàn),2-L的新的不倫瑞克（Brunswick，德國(guó)東部城市）高溫高壓滅菌發(fā)酵罐被用于所有批式反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，靜態(tài)燒瓶中的100毫升菌種經(jīng)過24小時(shí)的增殖被用作接種物。高壓滅菌后發(fā)酵罐分別加入介質(zhì)，滅過菌的碳源，接種物最后加入。最后容積為2升，pH值通過自動(dòng)添加NaOH保持在6.8和溶解的氧通過自動(dòng)增加攪拌保持30的空氣飽和度。樣品在固定間隔（4-6小時(shí)）被采集，分別

17、用于底物和產(chǎn)物的分析。,粗甘油或制備及預(yù)處理生物柴油廢物,為了評(píng)估粗甘油是否適合生產(chǎn)海藻糖和丙酸，生物柴油廢物被用，生物柴油廢物是使用豆油通過酯交換催化反應(yīng)而制成的 。粗甘油的合成物以前也被報(bào)道過。粗甘油與蒸餾水按照1:4的比例（體積/體積）混合，以降低流體的粘度，然后用鹽酸將流體的pH值調(diào)至3，轉(zhuǎn)換成游離脂肪酸。粗甘油溶液經(jīng)離心作用分離所形成的沉淀物為5000g，其后上清液的pH值用堿（KOH）調(diào)至12，緊接著再通過離心作用分離所形成的沉淀物。經(jīng)過第二次離心后最后得到的上清液的pH值調(diào)節(jié)至6.8. 在高壓滅菌過程中甲醇會(huì)被除去。,海藻糖的提取和分析,海藻糖的提取按照以前所報(bào)告那樣進(jìn)行 。對(duì)于

18、細(xì)胞內(nèi)海藻糖，洗滌后的細(xì)胞沉淀懸浮于2毫升的80乙醇中，并在水浴中煮沸直到體積減少到0.20.3毫升。檸檬酸鹽緩沖液（pH5.5 ，0.1M ）加入該提取物中，使最終體積為1毫升，離心分離后的上層清液用于海藻糖的定量分析。正如以前報(bào)道的那樣 通過酶催化海藻糖的方法（ Sigma-Aldrich公司）測(cè)定細(xì)胞提取液中的海藻糖的濃度。然后100ul的0.012 U的酶溶液中加入200ul細(xì)胞提取物，而對(duì)于對(duì)照溶液中加入100ul緩沖液代替酶。反應(yīng)混合物保持在37 搖床中過夜（約12小時(shí)）。已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)海藻糖（0.5克/升）也被培養(yǎng) ，還分別與培養(yǎng)的樣品對(duì)比，以確認(rèn)海藻糖被海藻糖酶完全水解。水解后形成的葡萄糖由DNS方法進(jìn)行定量。,有機(jī)酸的HPLC分析,HPLC在260 nm波長(zhǎng)條件下使用一個(gè)P