1、牙菌斑生物膜 (Dental Plaque Biofilm),口腔疾病研究國家重點實驗室 口腔生物學(xué)教研室 李雨慶,一、牙菌斑的定義（掌握） 二、牙菌斑的分類（了解） 三、牙菌斑的基本結(jié)構(gòu)（掌握） 四、牙菌斑的組成（了解） 五、牙菌斑的形成和發(fā)育（掌握） 六、牙菌斑的物質(zhì)代謝（了解） 七、牙菌斑的致病性（了解）,主 要 內(nèi) 容,牙菌斑（肉眼）,牙菌斑（LM）,牙菌斑細(xì)菌及EPS成分三維重建(CLSM),24h,48h,72h,玻片 樹脂 玻璃離子,不同牙科材料表面口腔細(xì)菌黏附,FISH技術(shù),一、定 義,1683年 發(fā)現(xiàn)牙面沉積物中有微小生物體（Van Leuwenhoek） 1890年 首次詳

2、細(xì)論證了細(xì)菌、酸和齲病三者的關(guān)系（Willoughby D. Miller ） 1897年 首先提出牙菌斑的概念（James Leon Williams） 1937年 牙面上的微生物必須依賴于牙面特定的菌斑環(huán)境代謝產(chǎn)酸（Forsdick） 1963年 牙菌斑是附著在牙面上不易被漱口液清洗掉的軟而粘的物質(zhì)（Dawes）,早期對牙菌斑的認(rèn)識,牙菌斑 (dental plaque),存在于牙面或牙周袋內(nèi)的一個細(xì)菌生態(tài)環(huán)境，細(xì)菌在其中生長、發(fā)育和衰亡，并進行著復(fù)雜的物質(zhì)代謝活動，在一定條件下，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物將會對牙齒和牙周組織產(chǎn)生破壞,James Leon Williams (April 18, 1

3、852 February 23, 1932) , American prosthodontist and pioneer dental histologist,各種細(xì)菌嵌于來自其自身和/或外界環(huán)境的胞外基質(zhì)內(nèi)，而在固相界面上結(jié)成的有著三維立體結(jié)構(gòu)的微生態(tài)環(huán)境，牙菌斑就是一種經(jīng)典的生物膜,JOHN WILLIAM COSTERTON (July 21st, 1934 -May 12th, 2012) “the father of biofilm”,生物膜（biofilm）,牙菌斑生物膜示意圖,牙菌斑生物膜是牙面上或牙周袋內(nèi)的多種菌叢構(gòu)成的生態(tài)系。細(xì)菌在內(nèi)生長、發(fā)育和衰亡。其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使它能包涵對

4、氧不同敏感性的細(xì)菌，這些細(xì)菌嵌入在由多糖、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)組成的基質(zhì)中。細(xì)菌在其中的代謝活動，影響著細(xì)菌與宿主之間或細(xì)菌菌屬之間的動態(tài)平衡,牙菌斑生物膜,節(jié)制細(xì)菌代謝活性和保護菌叢抵抗口腔苛刻環(huán)境，使細(xì)菌在不適合的條件中仍能存留。 膜內(nèi)高水平的巰基能中和氧基，保護菌細(xì)胞免受氧化損傷。 膜內(nèi)的多聚物基質(zhì)起約束網(wǎng)絡(luò)作用，攝取和收藏食物，控制基質(zhì)成分的移動速度。 濃縮從環(huán)境中來的營養(yǎng)物質(zhì)和其它元素，保留一些細(xì)胞內(nèi)遺漏出來的溶解物質(zhì)（如eDNA）。 細(xì)菌耐藥性,生物膜的作用,二、分 類,齦緣為界: 齦上菌斑 齦下菌斑：附著菌斑，非附著菌斑,（一）根據(jù)所在部位分類,1齦上菌斑（supragingival

5、plaque） 位于牙頸部齦緣以上牙面上的菌斑。包括窩溝菌斑、光滑面菌斑、鄰面菌斑、頸緣菌斑。這種菌斑的結(jié)構(gòu)比較完整，主要細(xì)菌是革蘭陽性球菌、桿菌。隨著菌斑成熟，革蘭陰性球菌、桿菌和絲狀菌的數(shù)量增多。,牙齦萎縮,2齦下菌斑(subgingival plaque) 位于齦緣以下，分布在齦溝或牙周袋內(nèi)，分為附著齦下菌斑和非附著齦下菌斑。,附著齦下菌斑,非附著齦下菌斑,非附著齦下菌斑 位于附著齦下菌斑的表面，為結(jié)構(gòu)較松散的菌群，直接與齦溝上皮和袋內(nèi)上皮接觸，主要為格蘭陰性厭氧菌，還包括許多能動菌和螺旋體, 附著齦下菌斑 由齦上菌斑延伸到牙周袋內(nèi)，附著于牙根面，其結(jié)構(gòu)、成分與齦上菌斑相似，細(xì)菌種類增多

6、，主要為格蘭陽性球菌及桿菌、絲狀菌，還可見少量格蘭陰性短桿菌和螺旋體,齦上、齦下菌斑的主要特征 特征菌 斑 齦上菌斑 齦下菌斑 生長環(huán)境 有氧、兼性厭氧 兼性、專性厭氧 優(yōu)勢菌 G+需氧菌和兼性菌 G-厭氧菌和能動菌 唾液清潔 + - 食物摩擦 + - 代謝底物 糖 類 血清蛋白、氨基酸、糖 宿主防衛(wèi)機制 唾液Ig 血清Ig,1. 致齲菌斑 與齲病發(fā)生有關(guān)的牙菌斑，多位于牙齒的咬合面、光滑面、鄰面和頸緣。主要的致病產(chǎn)物是各種有機酸，如乳酸。,（二）根據(jù)致病作用分類,（1）利用蔗糖的速度快，乳酸產(chǎn)生速度快； （2）產(chǎn)生多糖的速度快，接觸蔗糖15分鐘內(nèi) 20%以上轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)多糖； （3）變鏈球菌

7、的數(shù)量多，而非致齲性菌斑中 血鏈球菌的數(shù)量多； （4）與產(chǎn)堿代謝相關(guān)酶（尿素酶、精氨酸脫亞胺酶）的活性較非致齲菌斑低,致齲性菌斑的主要生物學(xué)特征:,2. 致牙周病菌斑 指位于齦緣和牙周袋內(nèi)，與牙周疾病發(fā)生有關(guān)的菌斑。此類菌斑因所處的生態(tài)環(huán)境不同，含更多的專性厭氧菌，如螺旋體。主要致病產(chǎn)物是破壞性酶和毒素,專性厭氧,產(chǎn)黑色素,牙周復(fù)合體,Socransky et. al. 1998. J Clin Periodontol,Most commonly found in patients with periodontal disease,Found in both healthy patients

8、and in periodontal lesions,三、基本結(jié)構(gòu),牙菌斑的基本結(jié)構(gòu)（LM）,牙菌斑緊靠牙面的獲得性膜，無細(xì)菌的均質(zhì)性結(jié)構(gòu)，HE染色呈紅色，厚度一般在1-10 m,（一）基底層,Enamel crystals,Pellicle lipid/protein layers (1-10 m),牙菌斑的主體部分，由粘附在獲得性膜上的絲狀菌彼此平行排列，且與牙面垂直構(gòu)成，絲狀菌之間有大量球菌、桿菌分布或互相粘附。有時平行排列的絲狀菌迫使球菌排成鏈狀，好似柵欄，稱為柵欄狀結(jié)構(gòu) (palisade structure)。柵欄狀結(jié)構(gòu)是牙菌斑的基本結(jié)構(gòu)，也為牙菌斑深層的細(xì)菌獲得營養(yǎng)和氧氣提供通道

9、。,（二）中間層,柵欄狀結(jié)構(gòu)（LM）,菌斑的表層結(jié)構(gòu)比較疏松，細(xì)菌組成復(fù)雜，變動較大，球菌和絲狀菌互相交織，短桿菌穿插其間?！肮人霠睢苯Y(jié)構(gòu)(corncob)，以絲狀菌為中心，周圍有許多革蘭氏陽性球菌粘附在其表面。以“谷穗”為中心，周圍有長桿菌粘附的“瓶刷樣”結(jié)構(gòu)(bristle brush)。,（三）表層,谷穗狀結(jié)構(gòu)（SEM）,四、組 成,1. 細(xì)菌的種類繁多。 2. 不同年齡階段微生物種類差異較大，組成呈動態(tài)變化。 3. 致病性菌斑與非致病性菌斑的細(xì)菌種類差異不大，功能差異較大。,（一）微生物組成的特點,A spectral fluorescence image of 15 differen

10、t species of human oral microbes grown in the laboratory and labeled with taxon specific probes in a CLASI-FISH experiment. (Credit: Alex Valm),Neighbor-joining tree for human oral taxa in the phylum Tenericutes and the classes Bacilli and Erysipelotrichia of the phylum Firmicutes,The Human Oral Mic

11、robiome. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Oct. 2010, p. 50025017,世界歷史分期,舊石器時代：通過狩獵和采集維持生活，制造簡單石器,中石器時代：開始家畜馴養(yǎng)，使用打制石器,新石器時代：產(chǎn)生了農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)，磨光石器流行,青銅時代：制造使用青銅器,鐵器時代：制造使用鐵器,中世紀(jì),近 代,現(xiàn) 代,石 器 時 代,古代,封建社會,碳水化合物大量攝入,工業(yè)革命/ 食物更為精細(xì)/糖,LBK/Bell Beaker,Jewbury/St. Helen-on the Wallis/Raunds Furnells,采集自正常人群相同部位的菌斑微生物組成種類差異較大，

12、但代謝功能相似。,Nature. 2012 Jun 13;486(7402):207-14.,牙齦卟啉單胞菌的檢出率明顯升高 開始有變異鏈球菌檢出,古代人口腔微生物的多樣性保持相對穩(wěn)定（p 0.05）,現(xiàn)代人口腔微生物的多樣性明顯減低,致齲性與非致齲性菌斑的細(xì)菌構(gòu)成 致齲性菌斑 細(xì)菌數(shù)量 非致齲性菌斑 變鏈球菌 多 粘性放線 血鏈球菌 血鏈球菌 粘性放線 變鏈球菌 乳酸桿菌 少 乳酸桿菌,致牙周病菌斑與非致牙周病菌斑的細(xì)菌構(gòu)成,（二）化學(xué)組成,1. 水 占菌斑體積的30%-50%，重量的80%， 其中50%在菌細(xì)胞內(nèi)，30%在菌斑基質(zhì) 中?；|(zhì)中的水大約25%呈游離狀態(tài)， 剩余部分與蛋白質(zhì)結(jié)合

13、呈結(jié)合態(tài)。,2. 蛋白質(zhì)和氨基酸 蛋白質(zhì)占牙菌斑干重40%-50%，主要來自宿主唾液和齦溝液，少量來自細(xì)菌。細(xì)菌蛋白則包括細(xì)菌本身以及細(xì)菌產(chǎn)生的酶，以及免疫球蛋白和少量的氨基酸。,3. 糖 占牙菌斑千重的13%-18%，來源于食物和細(xì)菌，包括低分子可溶性糖，如單糖、雙糖、低聚糖和多糖。,細(xì)胞內(nèi)多糖（Intracellular Polysaccharides, IPS） 存在于細(xì)菌體內(nèi)，作為一種儲能形式，當(dāng)外源性糖提供不足時，為菌斑細(xì)菌的新陳代謝提供能源。主要為糖原和支鏈淀粉。,細(xì)胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS） 存在于細(xì)菌體外，主要有葡聚糖、果聚

14、糖和少量的雜聚糖。細(xì)胞外多糖分為水溶性和水不容性兩種。,不同底物對生物膜EPS的影響,PLoS Pathog 8(4): e1002623.,生物膜形成過程中細(xì)菌細(xì)胞與EPS組成的動態(tài)變化,PLoS Pathog 8(4): e1002623.,4. 脂質(zhì) 占菌斑干重10%-14%，多位于菌斑基質(zhì)中，主要有磷脂、糖脂和中性脂。菌斑中的脂質(zhì)對菌斑的礦化和細(xì)菌對牙面的粘附有一定影響。,5. 無機物 占菌斑干重的5%-10%，主要有鈣、磷、鎂、鈉、鉀及少量的銅、鐵等。無機物一部分位于菌細(xì)胞內(nèi)，另一部分分布于菌斑液中。菌斑具有集中鈣、磷、氟的能力，菌斑中鈣、磷、氟含量明顯高于唾液。,五、形成和發(fā)育,T

15、he Biofilm Life Cycle,1、獲得性膜的形成 2、細(xì)菌的黏附和集聚 3、生物膜的成熟 4、生物膜的分散,（一）獲得性膜的形成,唾液糖蛋白選擇性吸附在牙齒表面所形成。,1. 形成機制,獲得性膜的形成機制,Enamel crystals,Pellicle lipid/protein layers (1-10 m),2. 組成 糖蛋白、酸性富脯蛋白、富酪蛋白、白蛋白、氨基酸、脂類物質(zhì)、碳水化合物、一些酶和免疫球蛋白等。,3. 生物學(xué)作用 （1）確定首先定植在牙面的細(xì)菌種類 （2）細(xì)菌代謝的營養(yǎng)來源 （3）保護釉質(zhì)表面 （4）牙面上的離子保護庫,1. 細(xì)菌的黏附：細(xì)菌在牙面上的附著

16、（1）鈣橋作用 （2）氫鍵作用 （3）疏水作用 （4）受體粘結(jié)素作用,（二）細(xì)菌的黏附和集聚,鈣橋作用,氫鍵作用,疏水作用,疏水基團,疏水蛋白,黏附素與受體,黏附素（Adhesin）：細(xì)菌表面的蛋白樣成分，以立體化學(xué)的特異方式結(jié)合到組織表面的受體上 受體（Receptor）：組織表面與黏附素結(jié)合的物質(zhì),黏附素與受體結(jié)合模式,主要口腔細(xì)菌的黏附素和受體,2. 集聚（aggregation） 一種細(xì)菌黏附于另一種細(xì)菌的表面稱之為集聚,（1）細(xì)菌間通過自身合成的細(xì)胞外聚 合物而相互粘附 （2）不同種細(xì)菌直接粘附在一起 （3）細(xì)菌與宿主的聚合物相互作用， 使細(xì)菌容易聚集在菌斑中,（三）牙菌斑生物膜的成

17、熟,牙菌斑的生長周期 成熟牙菌斑的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,牙菌斑的發(fā)育,牙菌斑（LM）,柵欄狀結(jié)構(gòu)（LM）,谷穗狀結(jié)構(gòu)（SEM）,谷穗狀結(jié)構(gòu)（FISH） 組合標(biāo)簽和光譜成像,（四）生物膜的分散,生物膜的分散,Biofilms can propagate through detachment of small or large clumps of cells, or by a type of seeding dispersal that releases individual cells. Either type of detachment allows bacteria to attach to a s

18、urface or to a biofilm downstream of the original community,Nature Reviews Microbiology. 2012; 10(1): 39-50,生物膜的分散,分散形式： 主動分散（active dispersal）：在外來刺激下，如營養(yǎng)變化、代謝產(chǎn)物堆積、溫度變化、噬菌體攻擊、酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)、右旋氨基酸等作用下進行；主動分散的細(xì)菌具有獨特的生物學(xué)特性，如鞭毛相關(guān)編碼基因被激活，細(xì)菌運動能力顯著增強； 被動分散（passive dispersal）：如唾液沖刷、食物咀嚼等，菌細(xì)胞無生物學(xué)特性改變,環(huán)二鳥苷酸(c-

19、di-GMP)是生物膜分散的核心分子,Nature Reviews Microbiology. 2012; 10(1): 39-50,Essential Steps of Biofilm Life Cycle,六、物質(zhì)代謝,1. 分解代謝 產(chǎn)生多種有機酸，如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。,（一）糖代謝,2. 合成代謝 （1）細(xì)胞內(nèi)多糖：糖原、支鏈淀粉 （2）細(xì)胞外多糖： Soluble ECP: -1,6 糖苷鍵 葡聚糖(右旋糖苷) -2,6糖苷鍵 果聚糖(左旋糖苷) Insoluble ECP: -1,3糖苷鍵 葡聚糖(glucan) 變聚糖 -2,1糖苷鍵 果聚糖(fructan),

20、（二）堿性物質(zhì)代謝 當(dāng)牙菌斑處于饑餓狀態(tài)時，菌斑內(nèi)尿素酶能夠?qū)⑼僖褐心蛩胤纸鉃榘?，二氧化碳，使牙菌斑pH上升。同時，菌斑中細(xì)菌可以利用氨基酸，使菌斑pH下降/上升。 目前認(rèn)為，細(xì)菌的產(chǎn)堿代謝是齲病發(fā)生的保護因素，口腔主要的產(chǎn)堿細(xì)菌包括格式鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、內(nèi)氏放線菌等。,尿素酶(urease)及精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase)是口腔細(xì)菌最主要的兩條產(chǎn)堿代謝通路，對維持口腔微生態(tài)平衡具有重要意義,（三）無機物代謝 在酸性環(huán)境中，磷酸鹽會變?yōu)橐兹芙獾南?，鈣釋放到基質(zhì)中。當(dāng)菌斑pH下降到臨界時(低于pH5.5)，羥磷灰石就會轉(zhuǎn)化為鈣/磷比值低的鹽： Ca10(PO4

21、)3(OH)2+8H+6CaHPO4+2H2o+4Ca2+,在酸性條件下，磷酸氫鈣(CaHPO4)進一步分解： CaHPO4+H+Ca2+H2P4O 當(dāng)牙菌斑pH上升，這時牙菌斑的鈣/磷比值又將增高。 10CaHPO4+8OH-Ca10(PO4)3(OH)2+4HPO42-+6H2O,七、致病性,牙菌斑是造成人類兩大口腔疾病-齲病、牙周病的始動因子。,（一）牙菌斑與齲病 1. 齲病是發(fā)生于牙齒硬組織的慢性細(xì)菌 性疾病，表現(xiàn)為牙體硬組織色、形、 質(zhì)的改變。 2. 致病性 （1）產(chǎn)酸性 （2）合成細(xì)胞外多糖對牙面的粘附能力 （3）耐酸性,Stephan曲線,Stephan 曲線： 進食后菌斑原位p

22、H變化過程 甜食頻率 vs 甜食的量 再礦化vs齲病形成所需時間,細(xì)胞內(nèi)、外多糖的種類和作用 1.種類:葡聚糖、果聚糖和少量的雜聚糖以及糖原和支鏈淀粉 2.作用: 作為菌細(xì)胞壁成分或位于胞內(nèi)。 作為菌斑基質(zhì)的主要成分，構(gòu)成菌斑的基本骨架。 作為細(xì)菌代謝所需的能源。 促進細(xì)菌對牙面的粘附和細(xì)菌間的聚集。,糖的種類與pH,（二）牙菌斑與牙周病 牙周病是發(fā)生在牙的支持組織的疾病，主要臨床癥狀是牙齦出血、溢膿、牙齒松動、牙槽骨吸收以及牙周袋形成，該病是造成成年人失牙的主要原因之一。,1. 牙菌斑代謝產(chǎn)物的直接破壞作用 （1）酶 （2）毒素 （3）其他產(chǎn)物,2. 牙菌斑引起的免疫病理損害 免疫反應(yīng)的類型是以細(xì)胞免疫為主，體液免疫參與，補體系統(tǒng)加入反應(yīng)兩個方面，在牙周炎癥的不同階段，各有特點。,小 結(jié),牙菌斑,定 義,基本結(jié)構(gòu),組 成,形成和發(fā)育,代 謝,致病性,