1、上海市結(jié)核病實驗診斷操作規(guī)范(適用于非點綜合醫(yī)院)、趙浩、上海市檢查分部微生物學(xué)組、主要內(nèi)容、結(jié)核病和實驗診斷概述結(jié)核病實驗診斷管理要求結(jié)核病實驗診斷的技術(shù)規(guī)范附錄、第一章結(jié)核病和失效診斷概述、結(jié)核病是嚴重危害國民健康的慢性傳染病，目前全球約有20億人感染，每年約有800億名結(jié)核病患者新出現(xiàn)，我國結(jié)核病患者人數(shù)排在世界第二位我國結(jié)核病年發(fā)病率約為130萬人，結(jié)核病死亡人數(shù)每年達13萬人，比其他傳染病死亡人數(shù)總和還多。結(jié)核病是我國重點預(yù)防的主要傳染性疾病之一。根據(jù)第一節(jié)的編寫目的和適用范圍，我國的結(jié)核病預(yù)防體系，結(jié)核病診療主要在定點醫(yī)院內(nèi)進行。最初感染患者的癥狀往往不典型，有輕度，甚至無癥狀結(jié)核

2、病，老年人的結(jié)核病癥狀容易被其他疾病掩蓋。牙齒患者的第一家診療醫(yī)院往往不是定點醫(yī)院。鄭智薰定點醫(yī)院實驗室人員一般不經(jīng)過結(jié)核桿菌檢查的正規(guī)訓(xùn)練和能力批準，操作程序、方法、檢查能力各不相同，容易導(dǎo)致錯誤的檢查結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)核病的誤診和誤診率增加。(威廉莎士比亞、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病、結(jié)核病基本知識)，第二節(jié)結(jié)核病基本知識，第一，結(jié)核病定義和傳播途徑，結(jié)核病是結(jié)核桿菌復(fù)合群傳播途徑主要通過呼吸道傳播。個人吸入結(jié)核桿菌所含的非泡沫后是否會得病取決于吸入結(jié)核桿菌的數(shù)量、毒性、個人抵抗力等多種因素。第二，結(jié)核桿菌生物學(xué)特性，結(jié)核桿菌復(fù)合組包括結(jié)核桿菌、牛枝菌、非洲分

3、枝桿菌、田鼠分枝桿菌，引起人類結(jié)核病的主要病原體是結(jié)核桿菌。結(jié)核桿菌為0.3-0.6 m1-4米大小，菌體細長，稍彎曲，兩端有點鈍。抗酸染色陽性是其重要特性。結(jié)核桿菌生長緩慢，至少需要2-4周才能出現(xiàn)可見菌落。結(jié)核桿菌細胞壁富含脂質(zhì)，約占細胞壁的60%，主要成分是分枝桿菌酸和酸化海藻糖。電子是抗酸染色反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。后者包括海藻糖雙枝菌根和黃肝酸，分別起到肉芽腫形成和保護細菌吞噬細胞記憶的作用，被認為是結(jié)核桿菌的毒性因素。第三，檢測分枝桿菌的臨床意義，臨床檢測分枝桿菌的最終目的是幫助分枝桿菌感染患者的診斷和治療。根據(jù)患者標本類型，分支桿菌的臨床意義也不同，實驗室應(yīng)盡快鑒定病原體，確定其臨床意義

4、。，(1)尋找非核菌、非核菌的臨床意義取決于多種茄子因素。林爽環(huán)境和宿主狀態(tài)病原體種類和致病性分離培養(yǎng)標本的來源和可檢測出污染可能性的病原體數(shù)量(包括抗酸染色涂片)陽性培養(yǎng)次數(shù)、非核菌與臨床疾病的關(guān)系、非核菌菌種林爽相關(guān)疾病標本院膿腫分枝桿菌或新枝病患囊胞性纖維變性或呼吸系統(tǒng)菌復(fù)合群(MAC)支氣管擴張的老年人偶發(fā)分枝桿菌食管松弛癥、慢性呼吸機回流病骨髓龜分枝桿菌、膿腫茄子慢性免疫抑制劑(如類固醇激素)菌或嗜血分枝桿菌引起的侵襲性皮膚損傷生物檢查/吸入物龜茲菌、龜茄子中央靜脈管、假肢、細菌偶發(fā)分枝桿菌或傷口、膿腫分枝桿菌注射部位、局部創(chuàng)傷生物檢查/吸入物、4 ，(a)痰涂片，優(yōu)點：操作簡單，價

5、錢便宜，可以快速檢測感染性肺結(jié)核。缺點：直接涂片法靈敏度相對不高，每毫升痰標本至少包含5000個棒細菌，才能檢測陽性。肺外結(jié)核、HIV合并感染結(jié)核病和非核菌(NTM)感染的涂層敏感度低。限制因素：抗菌(AFB)包膜鏡檢查不能區(qū)分結(jié)核桿菌和非核菌(NTM)，也不能區(qū)分絲狀菌和活菌、耐藥、敏感菌株。(b)分枝桿菌培養(yǎng)，優(yōu)點：分枝桿菌分離培養(yǎng)和菌株鑒定可以為結(jié)核病患者提供最終診斷標準，與涂層相比，陽性檢出率(通常提高30%-50%)有明顯提高。分離培養(yǎng)還為藥物敏感性實驗提供了實驗菌株。缺點：操作更復(fù)雜，價錢成本更高，菌體生長周期慢，需要專業(yè)實驗技術(shù)人員操作，用特殊實驗儀器培養(yǎng)，所有實驗都要保證在適當(dāng)

6、的生物安全條件下進行。限制因素：樣品在培養(yǎng)前必須清除污染，抑制其他雜菌的生長。所有去污操作對分枝桿菌有一定的危害，因此培養(yǎng)靈敏度達不到100%。(3)基因檢查和鑒定，優(yōu)點：檢查速度、操作標準化、潛在高流通量、低生物安全要求等明顯方面。2008年，WHO通過分子線性探針實驗(LPAs)認證，可以快速檢測利福平耐藥性(單獨耐藥或異煙肼聯(lián)合耐藥)。缺點：進行LPAs實驗仍需常規(guī)培養(yǎng)和DST。目前注冊的LPAs方法僅適用于涂末陰性陽性陽性或涂末陽性標本檢查。限制因素：LPAs適合在中央實驗室/國家比較室實施。如果能達到當(dāng)?shù)貙嶒炇业幕A(chǔ)設(shè)施牙齒要求，也可以考慮進行實驗。第三節(jié)相關(guān)術(shù)語，結(jié)核病：指肺內(nèi)結(jié)核

7、。罌粟花肺結(jié)核，有肺病灶的人也歸入肺結(jié)核。肺外結(jié)核：包括結(jié)核性腦膜炎、心包結(jié)核、腹膜結(jié)核、脊椎結(jié)核、脊椎外骨骼和關(guān)節(jié)結(jié)核、腸結(jié)核、生殖泌尿系統(tǒng)結(jié)核、淋巴結(jié)核和皮膚結(jié)核。胸腔內(nèi)肺門或縱膈腔淋巴結(jié)核或單純結(jié)核肋骨積液屬于肺外結(jié)核。痰涂片陽性肺結(jié)核(涂陽肺結(jié)核)至少一次用痰涂片顯微鏡檢查陽性，醫(yī)生判定胸部x光片的病灶符合肺結(jié)核的變化，決定實施完整的抗結(jié)核治療過程。至少有一次痰涂片顯微鏡檢查呈陽性，牙齒標本由結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性。、相關(guān)術(shù)語、痰涂片陰性肺結(jié)核(陰肺結(jié)核)定義1:至少三組痰標本涂片顯微鏡檢查結(jié)果均為陰性。胸部x線病變與活動肺結(jié)核的變化一致。臨床上，一周以上對廣譜抗生素治療沒有反應(yīng)(抗結(jié)核藥、

8、氟喹諾酮、氨基糖苷除外)。醫(yī)生決定臨床診斷結(jié)核病，實施完整的抗結(jié)核治療過程。定義2:痰涂片檢查為陰性，但痰陽性(陰培)醫(yī)生臨床診斷為肺結(jié)核，決定實施完整的抗結(jié)核治療過程。相關(guān)術(shù)語，耐藥結(jié)核(DRUG-Resistant Tuberculosis，DR-TB):在體外實驗中，結(jié)核患者被感染的結(jié)核桿菌對一種或多種抗結(jié)核藥有耐藥性。丹內(nèi)藥結(jié)核(Monodrugresistant Tuberculosis，DR-TB):在體外實驗中，結(jié)核患者被感染的結(jié)核桿菌對抗結(jié)核藥有耐藥性，這是事實。耐多藥結(jié)核病(MDR-TB):在體外實驗中，結(jié)核患者被感染的結(jié)核桿菌至少在一線抗結(jié)核藥中對異煙肼和利福平耐藥有耐藥性

9、。廣泛的耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB):體外檢查表明，結(jié)核病患者感染的結(jié)核桿菌至少對一級抗結(jié)核藥中的異煙肼和利福平耐藥有耐藥性，已被卡那霉素、阿米卡星、乳膏霉素中的任何一種注射，相關(guān)結(jié)核病樣品檢查(包括涂層、顯微鏡觀察、樣品的病原體分離純化、免疫學(xué)實驗、PCR核酸提取等初步檢查活動)可以在符合生物安全2級(BSL-2)的環(huán)境下進行。藥物敏感性實驗，生化鑒定建議在有負壓的BSL-2環(huán)境條件下進行。第二節(jié)實驗室設(shè)備條件，實驗室硬件設(shè)置包括但不限于具有II級以上生物安全、緊急沖擊裝置、顯微鏡、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌器、生物安全

10、杯的離心機等。各儀器設(shè)備必須有使用記錄，并按照相應(yīng)要求定期檢修。第三節(jié)員工需要具備檢查專業(yè)資格、優(yōu)秀的實驗室分支機構(gòu)檢查培訓(xùn)和生物安全培訓(xùn)和教育證書。要正確使用生物安全等實驗設(shè)備，理解其基本原理。必須明確遵守實驗室工作安全規(guī)定，接受實驗室管理員的監(jiān)督。收集實驗室職員的本低血糖癥，至少做胸部X線檢查，然后每年檢查一次，制作登記記錄。必要時，實驗室人員應(yīng)根據(jù)適當(dāng)、實驗室中接觸或可能接觸病原體的免疫接種或測試接觸的病原體定期進行檢查?；加袊乐丶膊?如免疫缺陷或免疫抑制)的員工應(yīng)禁止實驗室、未經(jīng)訓(xùn)練的合格實驗室人員進入實驗室。第四節(jié)生物安全要求，生物安全柜：必須具備實驗室II級以上的生物安全柜。生產(chǎn)氣

11、溶膠的工作，如標本處理、涂層、動物試驗等，都要在生物安全箱內(nèi)進行。每次實驗后必須打開紫外線燈，在生物安全柜內(nèi)進行1至2小時的物理消毒。定期擦拭和檢查紫外線燈的熒光燈，確認有效的消毒效果。離心機：離心感染性物質(zhì)離心時，要將檢查物放入密封的離心管，使用離心機后對表面消毒。廢物處理實驗室內(nèi)所有可能被污染的廢品(如手套、實驗室隔離服等)在報廢或重復(fù)使用之前，必須通過高壓滅菌或含氯消毒液等消毒。所有實驗使用的材料必須放在高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，滅菌后才能扔掉。，5節(jié)品質(zhì)管制要求，1，室內(nèi)品質(zhì)管制-涂層鏡檢查，新的試劑布置，以及每次涂層染色檢查，必須同時閱讀一張染色，陽性和陰性涂層。涂層可提前準備，熱固定后不染

12、色，4存儲在密封容器中。最好是用林爽標本離心沉積準備的涂層品質(zhì)管制精制。如果沒有臨床標本，可以利用戈登氏菌制作陽性對照劑，大腸埃希菌也可以準備女性對照劑。定期記錄，檢查結(jié)果，在以下情況下要注意。指定患者人口的陽性和陰性涂色率提高了。其他患者標本中出現(xiàn)了連續(xù)陶罐。都陽標本生長在沒有分枝桿菌的生長，陰標本固體培養(yǎng)基上。2以上。必須有室內(nèi)品質(zhì)管制-涂層鏡檢查，實驗室記錄的品質(zhì)管制程序，并記錄所有QC實驗的結(jié)果。失控的時候，要采取適當(dāng)?shù)募m正措施并記錄結(jié)果。所有徽章和試劑必須記錄批號和有效期。必須保存購買的商品培養(yǎng)基、實驗室供應(yīng)商提供的相應(yīng)培養(yǎng)基QC。實驗室可以徐璐定期監(jiān)測其他檢查結(jié)果參數(shù)的正常平均值，

13、以控制實驗過程的質(zhì)量。室內(nèi)品質(zhì)管制-培養(yǎng)，固體藥敏實驗：培養(yǎng)基品質(zhì)管制：要監(jiān)測培養(yǎng)基的外觀、顏色、質(zhì)地、凝固性、均勻性。藥物培養(yǎng)基無菌實驗使用同一批無藥培養(yǎng)基提取5%進行無菌性測試。藥純分：藥敏實驗應(yīng)使用制造商提供的藥標準粉或凈分，從制造商那里獲得藥粉的功效和純度。保存含藥培養(yǎng)基：培養(yǎng)基應(yīng)保存在冷藏環(huán)境下的密封袋中，保存期間空白培養(yǎng)基不得超過2個月。異煙肼室溫可保存，鏈霉素、乙胺丁醇、卡那霉素、丁烷胺卡那可保存冷藏、卷曲霉素、利福平冷凍保存。商業(yè)化液體藥敏試驗：遵循業(yè)務(wù)準則。室內(nèi)品質(zhì)管制-藥敏實驗，2，室間質(zhì)量評估，結(jié)核病實驗室所有林爽服務(wù)項目每年衛(wèi)生部，上海市林爽檢查中心或上海市疾病預(yù)防控制

14、中心組織的相關(guān)能力驗證和/或室間評估項目，滿足要求(例如沒有上述項目)，實驗室間的比較，可以判斷分析實驗的可靠性一年兩次以上。痰涂片鏡檢結(jié)果質(zhì)量要求，涂片語音匹配率95%以上，涂片陽性匹配率98%以上，總匹配率96.5%以上?！?”以上的良性涂層不允許假陰性。第三章技術(shù)規(guī)范，第一節(jié)基本技術(shù)要求牙齒部分內(nèi)容將結(jié)核桿菌檢驗基本技術(shù)應(yīng)用于鄭智薰定點醫(yī)院結(jié)核檢測實驗室。第一，收集、運輸和儲存標本，痰液：收集患者深部咳嗽痰，放入無菌容器(至少3毫升)。1h不能發(fā)送檢查、冷藏。血液：用無菌方法采集10毫升全血(成人至少5毫升，兒童1毫升)。冷藏冷凍是渡邊杏的。體液：無菌方法將10毫升液體采集到無菌管中。液

15、體量盡可能多，請不要在棉簽上蘸體液檢查。1h不能發(fā)送檢查、冷藏。膿標本：1小時檢查，不能冷藏。深部膿液：使用無菌方法用注射器提取膿液和/或采集組織。開放性損傷標本：應(yīng)盡可能在潰瘍期底部或邊緣采集，無菌采集組織標本。2，醫(yī)院學(xué)檢查方法，(1)涂料染色-樣品準備，幻燈片一張，只涂一個樣品。每張幻燈片只能使用一次，不能清洗后再用于涂層檢查。要用95乙醇擦脫脂(或浸泡)，并使用干燥、清潔、油、無劃痕的新幻燈片準備涂層，在幻燈片一端的磨砂表面上，要直接在鉛筆上寫患者姓名、樣品遞送檢查日期、樣品檢查編號。小心打開在生物安全柜里裝載標本的容器，防止氣溶膠或標本泄露。直接涂布法樣品用折斷的竹殘端從痰標本的膿、

16、奶酪樣品部分中選擇約50100l，在幻燈片正面的右2/3中間均勻涂上2cm1cm橢圓、厚、適當(dāng)?shù)耐坎?，放入烤箱干燥，準備染色。，涂層染?樣品制備，離心沉積法樣品制備高壓富集：將樣品放入10毫升內(nèi)高壓螺旋球的無菌管內(nèi)，在1:1中添加生理鹽水。121高壓20分鐘。將標本館放入有內(nèi)蓋的離心機中，3000g離心力15分鐘后采集沉淀道袍。道袍都要放在生物安全柜內(nèi)405繞制機干燥固定，時間為1小時。龍膽劑濃縮：龍膽劑和痰液以藥(13:1)的比例放入痰瓶，均勻竹簽，痰中粘液完全液化，濁度為1脈氏單位左右。3000克，離心10min，扔掉上清液，提取沉淀物50-100l，制作2cm1cm橢圓，厚，適當(dāng)?shù)挠筒?，放在烤面包機中烘干，準備。涂料染色-樣品制備，溴尼抗酸染色程序(冷鹽)加煤酸復(fù)紅溶液，復(fù)蓋痰膜，染色5分鐘以上(不需要加熱程序，染色期間痰膜應(yīng)復(fù)蓋染液，必要時可繼續(xù)添加染液)。水洗(以后盡量去除水分或濾紙吸)。添加酸性酒精溶液，脫色2分鐘；必要時，用流動的水去除脫色液，然后再次脫色，直到標本沒有可見的紅色水洗為止。加亞甲基藍溶液染色30秒，水洗，干燥。鏡子檢查(300個視野)。一張合格的染色藍色染成了阿加蘭，呈現(xiàn)出明亮的光芒。如果把染色的幻燈片放在報紙上，通過痰膜不能分辨報紙上的文字，你就會發(fā)