1、第七章 發(fā)酵染菌及防治,第一節(jié) 發(fā)酵異常現(xiàn)象及染菌分析 第二節(jié) 染菌對(duì)發(fā)酵的影響 第三節(jié) 染菌污染后的挽救和處理 第四節(jié) 染菌的預(yù)防措施 第五節(jié) 噬菌體染菌及防治,目的要求：,了解染菌對(duì)發(fā)酵工業(yè)的危害 掌握染菌的檢查方法 熟悉染菌的途徑 掌握染菌的防治方法 掌握噬菌體污染的防治方法,幾個(gè)問題：,1、染菌 2、染菌途徑 3、染菌檢查的方法 4、染菌防治的方法,發(fā)酵染菌防治的意義：,現(xiàn)代發(fā)酵利用的是微生物的純培養(yǎng)技術(shù)。 要嚴(yán)格無菌操作技術(shù)。 防止發(fā)酵過程中的染菌有著重要的意義： 保證產(chǎn)品的質(zhì)量、收率的穩(wěn)定。 保證發(fā)酵生產(chǎn)的有序進(jìn)行。 有利于節(jié)約型社會(huì)的建立。,第一節(jié) 發(fā)酵異?，F(xiàn)象及染菌分析,一、發(fā)

2、酵的異常現(xiàn)象 二、染菌檢查 三、染菌的原因及分析 四、染菌隱患的處理,一、發(fā)酵的異?，F(xiàn)象,（一）種子培養(yǎng)的異?，F(xiàn)象 （二）發(fā)酵的異?，F(xiàn)象,（一）種子培養(yǎng)的異常現(xiàn)象,1、菌體生長緩慢 原因：種子質(zhì)量差、培養(yǎng)基成分不穩(wěn)定、培養(yǎng)條件沒有控制到位。 2、菌絲結(jié)團(tuán) 原因：種子、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基。 3、代謝不正常 原因：培養(yǎng)基不合適、培養(yǎng)環(huán)境不良、接種量少、污染雜菌。,（二）發(fā)酵的異?，F(xiàn)象（p184-185）,1、消耗緩慢（菌體生長差） （1）原因：產(chǎn)生菌孢子和種子質(zhì)量不好、發(fā)酵條件差、培養(yǎng)基質(zhì)量差（滅菌不當(dāng)）等。 （2）措施：補(bǔ)充合適的氮源，或磷酸鹽，提高發(fā)酵溫度。 2、pH異常 發(fā)酵過程中一般pH是有

3、一定規(guī)律的。如不符合規(guī)律則是發(fā)酵異常。 （1）原因：培養(yǎng)基原料差、滅菌不徹底、加糖過于集中等。 （2）措施：可通過加酸或堿調(diào)節(jié)。最好加入一些生理酸性或堿性鹽或緩沖液來調(diào)節(jié)。,3、溶氧水平異常（p164）,正常發(fā)酵過程的溶氧水平是由一定規(guī)律的。如果溶氧水平與一般規(guī)律不一致即發(fā)生了異常變化。 （1）原因：染菌。染菌的種類：好氧菌、厭氧菌。菌體代謝異常、某些設(shè)備或工藝發(fā)生故障或變化。 （2）措施：檢查無菌空氣、管道是否滲漏。攪拌設(shè)備是否正常運(yùn)行等。,4、泡沫過多,發(fā)酵過程中泡沫的消長是有一定規(guī)律的。 （1）原因：種子過嫩或過老，致使菌體生長差、代謝速度慢，蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)多。 培養(yǎng)基滅菌溫度過高或時(shí)間

4、過長，培養(yǎng)基成分受到破壞。 （2）措施：接種優(yōu)質(zhì)種子、對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行合理滅菌。,5、菌體濃度過高或過低,由于溫度、氧氣、培養(yǎng)基、種子質(zhì)量、菌體自溶等影響微生物的生長，或感染噬菌體等，導(dǎo)致發(fā)酵液中微生物的濃度過高或過低。 微生物的濃度過低，發(fā)酵液轉(zhuǎn)?。?指發(fā)酵尚未進(jìn)入放罐階段，發(fā)酵液就變稀。 （1）原因：感染噬菌體、培養(yǎng)條件不合適。 （2）措施：防噬菌體、控制合適培養(yǎng)條件。 未知的其它原因：可補(bǔ)充氮源促菌絲生長，或補(bǔ)充碳源也可。 微生物的濃度過高，發(fā)酵液過濃： （1）原因：氮源過多，菌絲生長快、濃度大，從而降低發(fā)酵液中溶解氧的濃度，影響發(fā)酵正常進(jìn)行。 （2）措施：補(bǔ)入大量的水。,二、染菌檢查（p1

5、85-186）,在發(fā)酵過種中，對(duì)雜菌污染的及早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)處理，是免除染菌造成嚴(yán)重?fù)p失的重要手段。因此，要求有確切、迅速的方法來檢測出污染的雜菌。 目前常用的方法： （一）顯微鏡檢查 （二）肉湯培養(yǎng)檢查法 （三）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法 （四）發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法,（一）顯微鏡檢查,1、細(xì)菌用革蘭氏染色，必要時(shí)進(jìn)行芽孢染色和鞭毛染色，霉菌、酵母菌可直接觀察。,（二）肉湯培養(yǎng)檢查法,1、方法 液體培養(yǎng)基的檢查:將需要檢查的樣品接入經(jīng)滅菌，并經(jīng)過檢查無菌的肉湯培養(yǎng)基中，放置37和27分別培養(yǎng)24h，進(jìn)行觀察，觀察肉湯是否渾濁。并取樣鏡檢。 無菌空氣的檢查:將葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基裝在吸氣瓶中，

6、滅菌后，37培養(yǎng)24h，若培養(yǎng)液未變渾濁，表明吸氣瓶中的培養(yǎng)液是無菌的，把過濾后的空氣引入吸氣瓶中，培養(yǎng)后，若培養(yǎng)液變混或變黃色，表明空氣中仍有雜菌，說明過濾系統(tǒng)有問題。,2、應(yīng)用 （1）空氣過濾系統(tǒng)。 （2）液體培養(yǎng)基。 （3）噬菌體檢查，此時(shí)使用生產(chǎn)菌作為指示菌。,（二）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法,、平板劃線培養(yǎng) 固體平板置培養(yǎng)箱中37，保溫24h，檢查無菌即可使用。將需要檢查的樣品在無菌的平板上劃線，分別置37、27培養(yǎng)，以適應(yīng)嗜中溫和低溫菌的生長，一般在8h后即可觀察。 培養(yǎng)后，若出現(xiàn)與生產(chǎn)菌株形態(tài)不一的菌落，表明可能被雜菌污染。,、噬菌體檢查雙層平板培養(yǎng)法： 底層同為肉汁瓊脂培養(yǎng)基

7、，上層減少瓊脂用量，先將滅菌的底層培養(yǎng)基溶后倒平板，凝固后，將上層培養(yǎng)基溶解并保持40，加生長菌作為指示菌和待測樣品混合后迅速倒在底層平板上，置培養(yǎng)箱保溫經(jīng)1220h觀察有無噬菌斑。,（四）發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法（p186）,如可從溶解氧、pH值、排氣中CO2含量、菌體酶活力等變化來判斷。 1、溶解氧水平異常變化顯示染菌。 2、pH異常變化顯示染菌。 3、排氣中CO2異常變化顯示染菌。,谷氨酸正常發(fā)酵和異常發(fā)酵溶氧水平曲線：,三、發(fā)酵染菌的原因,（一）發(fā)酵染菌率 是指一年內(nèi)發(fā)酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比。 發(fā)酵染菌批數(shù) 總?cè)揪?100 總投料批數(shù) 發(fā)酵染菌率是指在發(fā)酵罐中發(fā)生的染菌率，

8、包括染菌后被挽救不了導(dǎo)致倒罐的批數(shù)，但種子罐培養(yǎng)的染菌不接入發(fā)酵罐，不導(dǎo)致發(fā)酵染菌的另行計(jì)算。,（二）染菌原因及分析,歸納發(fā)酵中染菌的主要原因有以下幾方面： 無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、種子帶菌、滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善等。 但還要具體問題具體分析。可從污染的雜菌種類、污染的時(shí)間、污染的程度等方面進(jìn)行綜合分析，才能作出正確的判斷，從而采取相應(yīng)的對(duì)策和措施。（p186-188）,1、染菌的雜菌種類分析,雜菌不同染菌的原因不同：（p187） 雜菌 原因 耐熱的芽孢桿菌 養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、設(shè)備存在死角 球菌、無芽孢桿菌等真菌 設(shè)備滲漏、無菌操作不當(dāng)、培養(yǎng) 基滅菌不徹底等,2、發(fā)酵染菌規(guī)模的

9、分析,（1）大批發(fā)酵罐染菌 A發(fā)酵前期：種子帶菌、連消設(shè)備染菌。 B發(fā)酵中后期：如是同一種菌則是無菌空氣出問題。 （2）部分發(fā)酵罐 A發(fā)酵前期：種子帶菌、連消設(shè)備染菌。 B發(fā)酵后期：中間補(bǔ)料染菌、補(bǔ)料管滲漏。 （3）個(gè)別發(fā)酵罐染菌 一般原因是設(shè)備滲漏造成的。,3、不同污染階段分析,種子培養(yǎng)階段染菌： 原因：種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素。 發(fā)酵開始階段染菌： 原因：種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、接種操作不當(dāng)或設(shè)備因素，無菌空氣等。 發(fā)酵后期染菌： 原因：無菌空氣、中間補(bǔ)料、設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題。,四、染菌隱患的處理（p188）,嚴(yán)格按操作工藝進(jìn)行 投產(chǎn)前

10、進(jìn)行整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的無菌測試 嚴(yán)格工人的管理 加強(qiáng)在線檢測技術(shù) 定期對(duì)設(shè)備維修,第二節(jié) 染菌對(duì)發(fā)酵的影響（p189）,絕大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵，無論是單菌發(fā)酵還是混合菌種發(fā)酵。都是純種發(fā)酵，除了菌種以外的微生物都被視為雜菌。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都可能遭受雜菌或噬菌體的污染，甚至由于染菌而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。,染菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)率、提取收得率、產(chǎn)品質(zhì)量和三廢治理都有很大影響。 一般生產(chǎn)不同品種污染不同種類和性質(zhì)的雜菌、污染時(shí)間、途徑、程度、培養(yǎng)條件等等，最終產(chǎn)生的后果不同。,染菌對(duì)發(fā)酵的影響：,染菌對(duì)不同品種發(fā)酵的影響不同 感染不同種類和性質(zhì)的雜菌對(duì)發(fā)酵的影響不同 不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響不同 染菌程度對(duì)發(fā)酵

11、的影響不同 染菌對(duì)產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 發(fā)酵染菌也造成三廢處理困難和對(duì)環(huán)境的污染,不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響不同：,種子培養(yǎng)期染菌：危害大，如發(fā)現(xiàn)染菌后應(yīng)滅菌后棄去。 發(fā)酵前期染菌：易使雜菌迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)和氧分。因此，應(yīng)迅速重新滅菌。 發(fā)酵中期染菌：將嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的合成。因此，應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)、快處理。 發(fā)酵后期染菌：如雜菌量不太多，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵；如污染量大，可提前放罐。此期染菌對(duì)不同產(chǎn)物的影響不同：如抗生素、檸檬酸影響不大；而肌苷、肌苷酸、谷氨酸等將影響產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量。,第三節(jié) 雜菌污染后的挽救和處理 (p190）,1、種子罐染菌的處理 及時(shí)

12、用高壓蒸汽直接滅菌后排放。 2、發(fā)酵罐染菌的處理 前期染菌：污染的菌對(duì)產(chǎn)生菌的危害大 ，蒸汽滅菌后放掉；污染的菌對(duì)產(chǎn)生菌的危害不大，重新滅菌重新接種； 污染的菌少，且生長慢，繼續(xù)運(yùn)行，并進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)的控制。 中后期染菌：加殺菌劑；培養(yǎng)溫度或控制補(bǔ)料量來控制染菌的生長速度。如產(chǎn)品含量達(dá)到一定值可以放罐。 3、染菌后設(shè)備處理 用化學(xué)物質(zhì)處理（如甲醛熏蒸）或徹底清洗，再用蒸汽滅菌（120，30min以上）。,第四節(jié) 染菌的途徑及預(yù)防措施（p190-198）,（一）種子帶菌的原因及防治 （二）無菌空氣帶菌及防治 （三）設(shè)備滲漏或設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治 （四）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防

13、治 （五）操作問題,（一）種子帶菌的原因及防治,1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底 2、菌種在移接過程中受污染 3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染,1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底,原因： 菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在殺菌鍋中進(jìn)行，造成滅菌不徹底的原因是滅菌鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時(shí)溫度達(dá)不到要求。 防止方法： 滅菌時(shí)鍋內(nèi)排氣完全。,2、菌種在移接過程中受污染,原因： 當(dāng)菌種移接操作不當(dāng)，或無菌室管理不嚴(yán)，就可能引起污染。 防止方法： 合理設(shè)計(jì)無菌室，嚴(yán)格無菌室管理制度，嚴(yán)格無菌操作接種。,3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染,原因：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于外界空氣進(jìn)入，也使雜菌進(jìn)入而受污染。

14、 防止： 試管的棉塞應(yīng)有一定的松緊度，不宜太松且有一定的長度； 培養(yǎng)和保藏溫度變化不宜太大； 每一級(jí)種子經(jīng)檢查合格后才能使用。,（二）無菌空氣帶菌及防治,在好氧發(fā)酵中通入的無菌空氣帶菌是發(fā)酵污染菌的主要原因之一 防止：空氣凈化流程和設(shè)備的設(shè)計(jì)要合理，過濾介質(zhì)的選用和裝填過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面都要適用、有效、合理。,（三）設(shè)備滲漏或設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治,1、設(shè)備滲漏引起的染菌及防治 發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、磨擦和振動(dòng)等原因，往往造成滲漏，從而引起染菌。 防治辦法：選用優(yōu)質(zhì)材料，并經(jīng)常進(jìn)行檢查。如冷卻蛇管的微小滲漏不易被發(fā)現(xiàn)，可以壓入堿性水，在可疑的地方，用

15、浸濕的酚酞指示劑的白布擦，如有滲漏時(shí)白布即顯紅色。,2、設(shè)備、管道存在“死角”造成的染菌及防治,“死角”：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該達(dá)到的局部滅菌部位，從而不能達(dá)到徹底滅菌的要求。這些部位即為“死角”。 其防治：主要從清洗和滅菌來防治。 “死角”可以是設(shè)備、管道的某一部位，也可以是培養(yǎng)基或其它物料的某一部分，如發(fā)酵罐中可存在許多死角。 （1）不銹鋼襯里破裂形成“死角”。 （2）發(fā)酵罐底部培養(yǎng)基的沉積污垢形成“死角”。 （4）管道轉(zhuǎn)彎處形成的“死角”。 （5）法蘭連接不當(dāng)造成“死角”。,（四）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治,1、原料

16、性狀 稀薄的培養(yǎng)基易滅菌徹底；而淀粉質(zhì)原料特別是有顆粒時(shí)易滅菌不徹底或是升溫過快或混合不均時(shí)，易結(jié)塊，使中心部位在滅菌時(shí)“夾生”，導(dǎo)致在發(fā)酵過程中團(tuán)塊散開而染菌。 防止措施： 淀粉質(zhì)培養(yǎng)基以實(shí)罐滅菌為好，在升溫時(shí)先攪拌均勻，并加入一定量的a淀粉酶進(jìn)行液化，并將原料大顆粒篩去。,2、實(shí)罐滅菌時(shí)未充分排除罐內(nèi)空氣 此種情況造成“假壓”使罐頂局部溫度達(dá)不到滅菌要求，導(dǎo)致滅菌不徹底而污染。 防止措施：在實(shí)罐滅菌升溫時(shí)，應(yīng)打開排氣閥門有關(guān)相連接管的邊閥、壓力表接管邊閥等，使蒸汽通氣達(dá)到徹底滅菌。 3、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時(shí)蒸汽壓力波動(dòng)大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底而受污染。 防止措施：培養(yǎng)基連續(xù)滅菌

17、時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制滅菌溫度，最好采用自動(dòng)控制裝置。,（五）操作問題,在發(fā)酵過程中由于操作不當(dāng)而引起雜菌污染：如移種時(shí)或發(fā)酵過程，罐內(nèi)壓力跌零，使外界空氣進(jìn)入而染菌；泡沫頂蓋而造成污染；壓縮空氣壓力突然下降，使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成污染等等。 防止措施：科學(xué)嚴(yán)密的管理，加強(qiáng)工人技術(shù)培訓(xùn)和責(zé)任心的教育，提高工人的素質(zhì)。,第五節(jié) 噬菌體染菌及防治（p198）,（一）噬菌體的污染 （二）噬菌體的檢查方法 （三）噬菌體污染原因及防治措施,（一）噬菌體的污染,1、噬菌體的污染 在發(fā)酵生產(chǎn)中常會(huì)遇到噬菌體（bacteriaphage）污染，引起溶菌，并隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止發(fā)酵等異?，F(xiàn)象。尤其是利用細(xì)菌或放

18、線菌進(jìn)行的發(fā)酵易受噬菌體的污染，由于噬菌體的感染率非常強(qiáng)，傳播蔓延迅速，且較難防治，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)有很大的威脅。,2、噬菌體污染的特征 （1）發(fā)酵液光密度上升緩慢，甚至下降，肉眼可見發(fā)酵液逐漸變清。 （2）耗糖速度緩慢或停止，產(chǎn)物生成量少，發(fā)酵液中殘?zhí)歉摺?（3）產(chǎn)生大量泡沫，發(fā)酵液呈粘稠狀。 （4）菌體不規(guī)則，甚至出現(xiàn)畸形。,3、噬菌體污染的途徑,噬菌體的直徑約0.1m，可通過環(huán)境污染、設(shè)備滲漏或“死角”、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底、補(bǔ)料過程及操作失誤、菌種帶進(jìn)噬菌體或本身是病原性菌株等途徑使發(fā)酵染菌。 在實(shí)際生產(chǎn)中，常由于空氣的傳播使噬菌體潛入發(fā)酵的各個(gè)環(huán)節(jié)，而造成污染。,（二）噬菌體的檢查方法,1、雙層瓊脂平板法 （1）雙層瓊脂平板的制備：上層培養(yǎng)基中加入0.2mL發(fā)酵菌種懸液和0.1mL待檢發(fā)酵液； （2）在發(fā)酵菌的適宜溫度下培養(yǎng)； （3）檢查有無透明的噬菌斑。 2、液體培養(yǎng)檢查法 將培養(yǎng)基、發(fā)酵菌種及待檢發(fā)酵液三者混合，培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)液是否變清。,3、斑點(diǎn)試驗(yàn)法 先制備好涂布有發(fā)酵菌種的平板，再用接種環(huán)或無菌吸管取少許發(fā)酵液在平板上點(diǎn)種，培養(yǎng)后，觀察是否有噬菌斑。