1、C 基因工程的理論基礎,1 基因工程的基本概念,B 基因工程的基本形式,A 基本定義,第十章 基 因 工 程 導 論,A 基本定義,1 基因工程的基本概念,基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。 因此，供體、受體、載體是基因工程的三大基本元件。,1 基因工程的基本概念,廣義的基因工程是指重組DNA技術的產業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；而下游技術則涉及到基因工程

2、菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產物的分離純化過程。,基因工程(gene engineering)常和以下名稱混用: 遺傳工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重組DNA技術(recombination DNA technique) 克隆(clone): 作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系. 作動詞時是指基因的分離與重組過程。,基因工程的操作過程,轉化子的篩選和鑒定（檢）,重組DNA分子的轉化和擴增（轉、增）

3、,DNA的體外重組（切、接）,基因工程的操作過程,切,接,轉,增,檢,B 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表達 經典基因工程,第二代基因工程 蛋白編碼基因的定向誘變 蛋白質工程,第三代基因工程 代謝信息途徑的修飾重構 途徑工程,第四代基因工程 基因組或染色體的轉移 基因組工程,C 重組DNA技術的理論基礎,19世紀中 孟德爾 豌豆雜交試驗 遺傳因子 經典遺傳學,20世紀初 摩爾根 果蠅雜交實驗 基因 基因學,1944年 艾弗瑞 肺炎雙球菌轉化實驗 遺傳物質DNA,1973年 伯格-杰克森-考恩-鮑耶 DNA分子體外拼接,分子遺傳學,1953年 沃森

4、-克瑞克 DNA雙螺旋結構 分子生物學,基因工程,2 基因工程的基本條件,C 用于基因轉移的受體菌或細胞,B 用于基因克隆的載體,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,2 基因工程的基本條件,限制性核酸內切酶,DNA連接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修飾酶,限制性核酸內切酶,限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能,識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈,主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵,細菌的限制與修飾作用,hsd R：編碼限制性核酸內切酶,hsd M：編碼限制性甲基化酶,hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達,1968年，Smith等人首先從流感嗜

5、血桿菌d株中分離出,Hind II和Hind III,限制性核酸內切酶,限制性核酸內切酶的類型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白結構,異源三聚體,同源二聚體,異源二聚體,切割位點,距識別序列1kb處,識別序列內或附近,距識別序列下游,隨機性切割,特異性切割,24-26bp處,限制性核酸內切酶,限制性核酸內切酶的命名,屬名 種名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株,同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶,限制性核酸內切酶,II 型限制性核酸內切酶的基本特性,識別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的

6、特定序列,大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側,識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的識別序列,EcoR I的切割位點,EcoRI等產生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等產生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 3

7、7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等產生的平頭末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,DNA連接酶,DNA連接酶的基本性質,修復雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵,DNA連接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G

8、-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,DNA連接酶,DNA連接酶的基本性質,修復與RNA鏈結合的DNA鏈上切口處的磷酸二酯鍵,T4-DNA連接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,ds-DNA結構: 切口, 缺口, 斷口,DNA連

9、接酶,DNA連接酶的基本性質,連接多個平頭雙鏈DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA連接酶,載體的功能及特征,載體的功能,運送外源基因高效轉入受體細胞,為外源基因提供復制能力或整合能力,為外源基因的擴增或表達提供必要的條件,載體的功能及特征,載體應具備的條件,具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）,具有合適的篩選標記,具有較高的外源DNA的載裝能力,具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點,具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點,質粒,質粒的基本特征,質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主

10、染色體而自主復制、并,被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子,質粒常見于原核細菌和真菌中,絕大多數(shù)的質粒是DNA型的,絕大多數(shù)的天然DNA質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，,即cccDNA,質粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb,質粒,質粒的構建,天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。,目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數(shù)幾個野生型質粒構建的：,pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標記基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內毒素標記基

11、因 E1,RSF2124 ColE1衍生質粒 氨芐青霉素抗性標記基因 Apr,質粒,重要的大腸桿菌質粒載體,松弛型復制,pBR322：,氯霉素可擴增,拷貝數(shù) 50 - 100 / cell,用于基因克隆,質粒,重要的大腸桿菌質粒載體,pUC18 / 19：,拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和測序,裝有多克隆位點（MCS）,正選擇顏色標記 lacZ,質粒,重要的大腸桿菌質粒載體,pUC18 / 19：正選擇標記 lacZ 的顯色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,

12、噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體的生物學特性： 生物結構,l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體,l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成,l-DNA全長48502個核苷酸,l-DNA上至少有61個基因,l 噬菌體生物學特性： 生物結構,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,頭部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重組基因,刪除與整合基因,l - DNA,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體生物學特性： 感染周期,體內包裝

13、,100個左右的拷貝,包裝范圍為原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,D,A,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構建：縮短長度,野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：,插入型載體,取代型載體,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構建：縮短長度 插入型載體

14、,體外包裝,插入位點,體外包裝,插入片段,載體長度 37 kb,插入片段大小：,0 - 14 kb,（51 37）,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA載體的構建：縮短長度 取代型載體,體外包裝,體外包裝,插入片段,最小裝載長度 10 kb,（51 26）,載體長度 26 kb,插入片段,最大裝載長度 25 kb,（36 26）,噬菌體或病毒DNA,大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l-DNA重組分子的體外包裝：,l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞 用于體外包裝的蛋白質可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包

15、裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的,考斯質粒,考斯質粒（cosmid）,考斯質粒載體的構建：,考斯質粒是一類人工構建的含有,1978年Collins和Hohn發(fā)明構建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和質粒復制子的,特殊類型的載體,cos site - carrying plas

16、mid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,裝載范圍為31 - 45 kb,考斯質粒,考斯質粒（cosmid）,考斯質粒載體的特點：,能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞,裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍,能像質粒那樣在受體細胞中自主復制,重組操作簡便，篩選容易,不能體內包裝，不裂解受體細胞,人造染色體載體,人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百,甚至上千 kb 的DNA片段， 此時考斯質粒的裝載量也遠遠不能滿足需要。,將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn),定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外,源DNA

17、克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，,它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。,目前常用的人造染色體載體包括：,細菌人造染色體（BAC）,酵母人造染色體（YAC）,人造染色體載體,酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC載體應含有下列元件：,酵母染色體的端粒序列,酵母人造染色體的構建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色體的復制子,酵母染色體的中心粒序列,酵母系統(tǒng)的選擇標記,大腸桿菌的復制子,大腸桿菌的選擇標記,YAC載體的裝載量為350

18、- 400 kb,人造染色體載體,酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色體的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,連接,轉化酵母菌,重組酵母染色體,C 用于基因轉移的受體菌或細胞,3 基因工程的基本條件,各種基因工程受體的特性,實驗室常用的基因工程受體,受體細胞應具備的條件,受體細胞應具備的條件,限制性缺陷型,外切酶和內切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）,重組整合缺陷型,用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）,具有較高的轉化效率,具有與載體選擇標記互補的表型,感染寄生缺陷型,防止重組細菌擴散污染

19、，生物武器除外,實驗室常用的基因工程受體,大腸桿菌,用于接受質粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受l-DNA：LE392、ED8654,酵母菌,哺乳動物細胞 CHO,畢赤酵母,啤酒酵母,3 基因工程的操作過程,C 轉化子的篩選和鑒定（檢）,B 重組DNA分子的轉化和擴增（轉、增）,A DNA的體外重組（切、接）,3 基因工程的操作過程,切,接,轉,增,檢,A DNA的體外重組（切與接）,3 基因工程的操作過程,同種內切酶生產的粘性末端的連接,同尾酶生產的粘性末端的連接,不同粘性末端的連接,粘性末端的更換,人工粘性末端的連接,重組率,同

20、種內切酶生產的粘性末端的連接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,B 重組DNA分子的轉化和擴增（轉與增）,3 基因工程的操作過程,轉化的原理與技術,轉化率,轉化細胞的擴增,轉化的原理與技術,Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化,Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài),轉化的原理與技術,電穿孔轉化,將待轉化的質?；駾NA重組連接液

21、加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內 電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質粒消除實驗,C 轉化子的篩選和鑒定（檢）,3 基因工程的操作過程,由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉化子與非轉化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子,轉化子,重組子,目的重組子,載體遺傳標記檢測,抗藥性篩選法,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,Eco

22、R I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,抗藥性篩選法的基本原理：,pBR322,4363 bp,ori,抗藥性篩選法可區(qū)分轉化子與非,轉化子、重組子與非重組子,將外源DNA片段插在EcoRI位點：,非重組子呈 Apr、Tcr,重組子呈 Apr、Tcr,將外源DNA片段插在BamHI位點：,非重組子呈 Apr、Tcr,重組子呈 Apr、Tcs,載體遺傳標記檢測,抗藥性篩選法,抗藥性篩選法的基本操作：,先將轉化液涂布含有Ap的平板,再將Ap平板上的轉化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生長、但在Ap和Tc,平板上不長的轉化子即為,Ap,Ap + Tc

23、,影印,挑選,重組子,載體遺傳標記檢測,顯色篩選法,顯色篩選法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap + X-gal,重組子（Apr + lacZ-）,將外源基因克隆在pUC18的lacZ標記基因內部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落,核酸分子雜交,Southern雜交檢測DNA,Southern雜交檢測DNA,A 鳥槍法,4 目的基因的克隆與基因文庫的構建,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,鳥槍法操作的改進,鳥槍法克隆目的基因的局限性,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快

24、速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離,B cDNA法,4 目的基因的克隆與基因文庫的構建,cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,cDNA法分離目的基因的基本程序,cDNA法法克隆目的基因的局限性,cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,mDNA,cDNA第一鏈的合成,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,cDNA第一鏈,引物,退火,逆轉錄酶,dNTPs,cDNA第二鏈的合成,煮沸,NaOH,自身引導法：獲得的雙鏈cD

25、NA 5端會有幾對堿基缺失,AAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTT,OH 3,Klenow,dNTPs,S1,cDNA第二鏈的合成,DNApol dNTPs,RNaesH,置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAp 5,5,S1,AAAATTTOH 3,TTTTTTTTTTTT

26、TTp 5,5,TTTTTTTTTTTTTTOH 3,AAAAAAAAAAAAAA 5,5,TTTTTTTTTTTTTT 3,3,T4-DNA ligase,cDNA第二鏈的合成,dCTP,TdT,引導合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列,AAAAAOH 3,TTTTTp 5,3 HO,AAAAACCCCCCCOH 3,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,AAAAAOH 3,NaOH,退火,Klenow,dN

27、TPs,cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,雙鏈cDNA的克隆,雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：,平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收,平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組,分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段,加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA結構,細菌或原核生物的mRNA半衰期很短,mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，,分離純化困難,僅限于克隆蛋白質編碼基因,E 基因文庫的構建,4 目的基因的克隆與基因文庫的構建,基因文庫的基本概念,基因文庫的構建程序,基因組文庫重組克隆的排序,基因文庫的基本概念,基因庫與基因文庫,基因庫（gene pool）,特定生物體全基因組的集合（天然存在）,基因文庫（gene library or gene bank）,從特定