1、I. 常見問題 基線噪音,可能的原因：,流動(dòng)池臟,檢測(cè)器燈有問題,如果是周期性的，電壓或泵的脈沖,溫度對(duì)檢測(cè)器的影響,氣泡經(jīng)過檢測(cè)器,基線漂移, 梯度洗脫 溫度不穩(wěn)定 (示差檢測(cè)器） 流動(dòng)相中有污染物 柱中的流動(dòng)相沒有平衡 體系中有污染物流出,可能的原因：,鬼 峰,鬼峰即使不進(jìn)樣也會(huì)出現(xiàn)的峰,沒有進(jìn)樣,3,7,15,17,問題1- 流動(dòng)相臟 問題2- 容器污染 問題3- 柱子污染,20% - 100% MeOH,沒有進(jìn)樣,峰 型,雙 峰,柱 塌 陷,柱中有死體積,過濾片部分堵塞,只有一個(gè)雙峰組分的共洗脫,可能原因：,樣品與溶劑不匹配，溶劑與柱子不匹配,峰 型,所有的峰都展寬,柱效降低柱死體積,

2、大進(jìn)樣量 / 質(zhì)量,高粘度流動(dòng)相,部分峰展寬,前次進(jìn)樣后流出的組分,大分子量樣品蛋白或聚合物,樣品與流動(dòng)相不匹配,峰 型,原因：,部分峰拖尾,二次保留效應(yīng)殘留硅醇基的反應(yīng),小峰緊跟在大峰的后面流出,柱頭有污染,金屬,所有峰拖尾,額外的柱效應(yīng),柱壞/不適當(dāng)?shù)娜軇?不適當(dāng)?shù)臉悠妨?峰 型,峰 型,原因: 流動(dòng)相吸收本底高 進(jìn)樣過程中進(jìn)了空氣 離子對(duì)分離中的系統(tǒng)峰 樣品組分的吸收(RI或UV)低于流動(dòng)相,寬 峰,柱外體積增加,* 在進(jìn)樣口到柱或柱到檢測(cè)器之間，使用細(xì)的短的連接管 * 保證所有的管路接頭都使用正確 * 用小體積檢測(cè)池 * 減少進(jìn)樣量或降低樣品濃度,HPLC常見問題,系統(tǒng)壓力問題 壓力高

3、 壓力低或沒有壓力 壓力不穩(wěn) 流路基線噪音問題 基線不穩(wěn)定(不重復(fù)) 長(zhǎng)、短程振蕩 基線漂移 噪音脈沖尖刺,HPLC常見問題分析,系統(tǒng)壓力問題 壓力高的原因 溫度太低 流速太高 流動(dòng)相粘度大 管路堵塞 儀器或色譜柱堵塞 壓力傳感器問題,HPLC常見問題分析(續(xù)),系統(tǒng)壓力問題 壓力低或沒有壓力 溫度太高;流速太低 泵關(guān)閉或保險(xiǎn)絲斷了 泵未輸送流動(dòng)相 儲(chǔ)液瓶中無溶劑 低壓限設(shè)置不當(dāng)泵未正確排氣 溶劑入口過濾頭堵 入口管路中有空氣泵失效 系統(tǒng)內(nèi)有滲漏處 所用溶劑不正確 自動(dòng)進(jìn)樣器在Purge時(shí)卡住,HPLC常見問題分析(續(xù)),系統(tǒng)壓力問題 壓力不穩(wěn) 壓力傳感器問題 泵排氣不充分 泵失效 流動(dòng)相未正

4、確脫氣 所用溶劑不混溶或易揮發(fā),HPLC常見問題分析(續(xù)),流路基線噪音問題 短程振蕩 泵壓不穩(wěn) 泵入口管松,彎或堵塞 溶劑混合不充分 檢測(cè)池中有大氣泡 泵入口閥臟或失效 泵柱塞桿密封墊磨損 檢測(cè)器出口溶液成滴狀流入廢液瓶,判斷故障與故障排除的原則,規(guī)則一確認(rèn)問題至少發(fā)生兩次以上。如果問題不重復(fù) 出現(xiàn)，很難證實(shí)其確實(shí)存在。 規(guī)則二一次只變化一個(gè)因素，以使你能夠確認(rèn)所變因 素與問題之間的關(guān)聯(lián)。 規(guī)則三恢復(fù)原狀。如果使用更換組件方法來查找問題 之所在,完畢后應(yīng)將原有完好組件安裝回原處。 否則,換下的組件將來很難再利用,會(huì)造成浪費(fèi)。 規(guī)則四嘗試預(yù)測(cè)將來可能發(fā)生的問題。利用成功的故 障排除經(jīng)驗(yàn)來改善您

5、目前的預(yù)防保養(yǎng)工作,使現(xiàn) 有問題再發(fā)率降至最低。 規(guī)則五養(yǎng)成記錄的好習(xí)慣。一個(gè)好記錄是成功地進(jìn)行 故障排除的關(guān)鍵。,色譜圖常見問題,色譜圖常見問題主要有兩類: 色譜峰峰形異常問題 例如負(fù)峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對(duì)稱等 色譜峰保留時(shí)間問題 保留時(shí)間不穩(wěn)定等,色譜圖常見問題分析(一),色譜峰峰形異常問題: 色譜圖中未出峰: 進(jìn)樣問題:未進(jìn)樣或樣品分解 流動(dòng)相問題:泵未輸液或流動(dòng)相不正確 檢測(cè)器設(shè)置不正確,或檢測(cè)器有問題 一個(gè)或幾個(gè)峰是負(fù)峰 流動(dòng)相吸收本底高 進(jìn)樣過程中進(jìn)了空氣 離子對(duì)分離中的系統(tǒng)峰 樣品組分的吸收(RI或UV)低于流動(dòng)相,色譜圖常見問題分析(一)(續(xù)),色譜峰峰形異常問題: 峰

6、比預(yù)想的要小 樣品粘度過大 進(jìn)樣器有問題或進(jìn)樣體積有誤 檢測(cè)器設(shè)置不正確,定量環(huán)(Loop)體積不正確 檢測(cè)器輸出未置零 用了不正確的檢測(cè)器輸出信號(hào) 檢測(cè)池被污染 檢測(cè)器的燈可能有問題,色譜圖常見問題分析(一)(續(xù)),色譜峰峰形異常問題: 雙峰或肩峰 進(jìn)樣量或樣品濃度過大 保護(hù)柱或色譜柱進(jìn)口堵塞 保護(hù)柱或色譜柱污染或失效 前伸峰 進(jìn)樣量或樣品濃度過大 溶樣的溶劑相對(duì)于流動(dòng)相太強(qiáng) 保護(hù)柱或色譜柱污染或失效,色譜圖常見問題分析(一)(續(xù)),色譜峰峰形異常問題: 拖尾峰 保護(hù)柱或色譜柱問題:污染或失效(選擇合適的柱子) 進(jìn)樣問題 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確 平頭峰 檢測(cè)器設(shè)置不正確 進(jìn)樣體積太大或樣品濃度

7、太高,色譜峰保留時(shí)間問題: 保留時(shí)間飄忽不定(各次運(yùn)行之間) 系統(tǒng)不穩(wěn)定或未達(dá)化學(xué)平衡 泵壓力不穩(wěn)(泵頭里有氣泡) 進(jìn)樣體積過大或樣品濃度過大 溫度波動(dòng) 流動(dòng)相混合不均勻 色譜柱被污染,色譜圖常見問題分析(二),色譜峰保留時(shí)間問題: 保留時(shí)間增加或減少(各次運(yùn)行之間) 系統(tǒng)不穩(wěn)定或化學(xué)平衡不足 泵流速變化 溫度變化 色譜柱污染,柱效下降 流動(dòng)相被污染 溶劑入口過濾器堵或管路堵塞 系統(tǒng)滲漏,色譜圖常見問題分析(二)(續(xù)),色譜圖常見問題分析(二)(續(xù)),色譜峰保留時(shí)間問題: 保留時(shí)間改變到一個(gè)新的恒定值 流動(dòng)相不正確或其組成不正確 泵流速變化 實(shí)際輸液的流速不正確(泵失靈或故障) 環(huán)境溫度變化；

8、柱溫不正確 色譜柱尺寸或類型不正確 色譜柱被污染 流動(dòng)相含有穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑發(fā)生變化 輸液系統(tǒng)的梯度滯后體積不正確,液相色譜實(shí)用技術(shù) 色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的選擇,非極性或極性較小的樣品可用一般的C18柱 酸堿性的化合物建議選用填料經(jīng)封尾鈍化過的C18柱，PH范圍2-9（12） 糖類，氨基酸，有機(jī)酸，多環(huán)芳烴，GPC有專用柱,鍵合相色譜柱,以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上作為固定相。這種固定相要占所有柱填料的60-70% 優(yōu)點(diǎn) 固定相穩(wěn)定，不易流失 應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑 消除硅羥基的不良影響 缺點(diǎn) pH值不能小于2或大于8 同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相

9、同,反相HPLC柱（C18）的性能,常規(guī)C18填料的穩(wěn)定性 硅膠基質(zhì)填料 pH范圍：2-8 pH值大于7時(shí)鍵合相粉碎或溶解 pH值小于2時(shí)鍵合相的化學(xué)鍵斷裂 經(jīng)常用緩沖液 固定相降解 填料新的鍵合技術(shù) - PH范圍 2-12 - 穩(wěn)定性好，使用壽命長(zhǎng),良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣,拿到一根新色譜柱時(shí)，先測(cè)柱效 保留在新色譜柱上測(cè)得的色譜圖，并記錄條件 定期檢測(cè)柱效,色譜柱的使用及操作,流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換 特別是GPC柱 流速(壓力)的變化幅度 溫度的變化幅度 專用色譜柱樣品及溶劑的要求,色譜柱的保養(yǎng)（一）,樣品方面 除去微粒及雜質(zhì) 了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度 如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防

10、止其在流動(dòng)相中析出 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用,樣品準(zhǔn)備,為什么溶劑和樣品要過濾?,溶劑和樣品過濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。 樣品過濾頭的類型： 30mm 內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。 13mm 內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m 和0.45m

11、兩種規(guī)格,材料為纖維素。 3mm 內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。,色譜柱的保養(yǎng)（二）,流動(dòng)相方面 除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低（建議走空白檢驗(yàn)） 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi) 緩沖液（鹽）的濃度 溶劑：色譜純，并與填料相匹配 溶劑中的雜質(zhì)含量 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑 流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度 有機(jī)溶劑或水的比例,溶劑過濾-除去微粒,不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長(zhǎng)菌的溶劑會(huì)阻塞溶劑過濾器以及色譜柱。 遵從下列建議可以提高性能，延長(zhǎng)溶劑過濾器和色譜柱的壽命： 使用無菌溶劑瓶避免溶劑長(zhǎng)菌。 用濾膜過濾

12、溶劑去除微生物。 每?jī)商旄鼡Q或過濾溶劑。 避免溶劑瓶直接日照。 向溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉。,溶劑準(zhǔn)備：過濾,選擇合適的濾膜,聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：適用于水基溶劑，不適用于有機(jī)溶劑，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)的樣品。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸、70%乙醇、二氯甲烷、不適用于DMF二甲基甲酰胺 再生纖維素濾膜：具有蛋白質(zhì)吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑。 注意：1）每張濾膜只能用一次。 2）水相和有機(jī)相不要搞混。,溶劑的相溶性,溶劑信息,避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑： 鹵化物堿金屬溶液

13、和相應(yīng)的酸溶液。 高濃度的無機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。 能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。 含有過氧化物的色譜級(jí)醚必須用氧化鋁干燥劑。 在有機(jī)溶劑中的有機(jī)酸溶液。 含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。 四氯化碳和異丙醇或THF混合液。,溶劑截止波長(zhǎng),溶劑準(zhǔn)備：脫氣,流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？,流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。,常用的脫氣方法比較

14、：,氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。 在線真空脫氣法：LC 真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。,典型的流速,流動(dòng)相的保存,有機(jī)溶劑流動(dòng)相: 室溫下密封,避光保存 緩沖鹽流動(dòng)相: 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用 低溫下密封保存,一般不超過3天 防止長(zhǎng)菌 有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相: 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā)

15、選用適宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超純水,測(cè)試條件 水樣: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色譜柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 線性 100% 水 100% 乙腈 波長(zhǎng): 254 nm,保存于標(biāo)準(zhǔn)棕色玻璃瓶中的超純水,測(cè)試條件 水樣: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色譜柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 線性 100% 水 100% 乙腈 波長(zhǎng): 254 nm,色譜柱日常使用,過濾所有的溶劑和樣品 使用保護(hù)柱 不要把柱接頭上得太緊，損壞接頭螺紋易滲液 開機(jī)時(shí)，流速和柱壓要逐漸增加 進(jìn)樣前檢查色

16、譜系統(tǒng)的各個(gè)接頭是否有漏液 注意色譜柱的pH值使用范圍 不要高溫下過長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相柱子 關(guān)機(jī)前先用水沖洗整個(gè)系統(tǒng)，移走緩沖液后再用有機(jī)相沖洗 不要高壓沖洗柱子,色譜柱保護(hù),在線的保護(hù)裝置,給色譜柱提供物理的保護(hù) 除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒 給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù) 防止分析柱被化學(xué)污染 裝置 在線過濾器 自裝填料保護(hù)柱 預(yù)裝保護(hù)柱,新型的保護(hù)柱,特點(diǎn) 高質(zhì)量, 高效填料 - 不損失柱效 增加分析柱效 - 增加適應(yīng)范圍 20mm柱長(zhǎng) - 臟樣品載荷能力大，能延長(zhǎng)保護(hù)柱壽命 手可擰緊接頭，安裝時(shí)不需要工具 通用柱套 - 適用于所有的HPLC柱(3.9及4.6內(nèi)徑) 整體式- 使用方便，容易 各種

17、不同填料配合色譜柱,色譜柱常見毛病,柱壓過高 多少才算高? 不同色譜柱有差異 不同系統(tǒng)有差異 不同溶劑有差異 柱效低 重復(fù)性差 不出峰，回收率低,柱壓過高,為什么柱壓會(huì)過高 微粒堵塞 樣品 流動(dòng)相 密封墊 柱床膨脹 不可逆吸附 細(xì)菌生長(zhǎng),柱效低,為什么柱效低 色譜柱被污染 過濾片部分堵塞 樣品、流動(dòng)相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞 色譜柱內(nèi)的死體積 流動(dòng)相pH值及組成不合適造成固定相流失 流速急劇變化造成固定相物理損壞 機(jī)械震動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫 柱床收縮或干枯,重復(fù)性差、回收率低,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差 色譜柱被污染 流動(dòng)相pH值及組成不合適造成鍵合相流失 樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定 回收率低，不出

18、峰 “不可逆”吸附 固定相過強(qiáng)或流動(dòng)相過弱 非特異性吸附,色譜柱的日常清洗,對(duì)所做的樣品要有充分的了解 用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈） 硅膠柱的一般方法 先用甲醇洗去極性雜質(zhì)，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 鍵合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗 柱子尺寸 柱子體積 沖洗體積 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4.2ml 80ml *再有雜質(zhì)嚴(yán)格清洗： 20倍柱體積的水-相同體積的0.05mol/L硫酸，最后用流 動(dòng)相清洗,色譜柱的清洗-物理阻塞,在安裝柱前后測(cè)試壓力差 如果柱壓力太高，反裝色譜柱，并用10-20倍柱體積的 流動(dòng)相沖洗色譜柱，監(jiān)測(cè)壓力變化 若出現(xiàn)沉淀 (如：蛋白凝聚、細(xì)胞物、聚合物) 設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如 0.1% TFA/ 80% 乙腈, 6M 鹽酸胍, THF, HFIP 若仍無效，應(yīng)考慮更換過濾片,色譜柱頭塌陷的修補(bǔ),柱頭有塌陷可用填料修補(bǔ)： 1）松開柱入口接頭，拆下不銹鋼燒結(jié)過濾器，常見柱頭塌陷，剔掉無規(guī)則床層和帶色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少許填料使沉降，如此反復(fù)多次后，用刮刀將填料