1、第一章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,第一節(jié)：商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備,主要內(nèi)容： 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì) 儀器設(shè)備和器皿用具,在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對(duì)工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來沒計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。,一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),組培實(shí)驗(yàn)室

2、設(shè)計(jì)原則：,保證無菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。,組培實(shí)驗(yàn)室組成：,標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括: 洗滌室（區(qū)） 制備室（區(qū)） 滅菌室（區(qū)） 儲(chǔ)放室（區(qū)） 操作室（區(qū)） 培養(yǎng)室（區(qū)） 觀察室（區(qū)） 藥品室（區(qū)）, 可以根據(jù)自己的實(shí)際條件進(jìn)行合并,準(zhǔn)備室：完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設(shè)備： 藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計(jì)及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器. 洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。主要設(shè)備：水池、操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。,臥式滅菌鍋,無菌操作室（接種室）： 主要用于植物材料的消毒、接種、

3、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進(jìn)行無菌操作的技術(shù)程序。主要設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺(tái)、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。 接種室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。 要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。 接種室應(yīng)設(shè)有緩沖問，面積1m2為宜。進(jìn)入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時(shí)帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。,超靜工作臺(tái),酸

4、度計(jì),培養(yǎng)室： 培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。其大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。主要設(shè)備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、搖床、培養(yǎng)箱、紫外光源等。培養(yǎng)材料放在由金屬制成培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架一般設(shè)5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高17m左右。其長(zhǎng)度根據(jù)日光燈長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)， 如采用40W日光燈，則長(zhǎng)I3m，30W的長(zhǎng)lm，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在2027左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。由于熱帶植物和寒帶植物等不

5、同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對(duì)濕度以保持在70%80%為好，可安裝加濕器?？刂乒庹諘r(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，也有的需要連續(xù)照明。現(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。,細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 該室用于對(duì)培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)等。主要設(shè)備：雙筒實(shí)體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。小型儀器設(shè)備有：分注器、血球計(jì)數(shù)器、移液槍、過濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺(tái)式離心機(jī)等。,顯微鏡,顯微鏡,玻璃器皿及用具,玻璃器皿 培養(yǎng)用的

6、：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等； 顯微鏡下觀察用的：細(xì)胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等。 微孔過濾器（細(xì)胞過濾器） ：激素用于滅菌。 一般用石棉濾膜,第二節(jié)：培養(yǎng)基及其配制,主要內(nèi)容： 培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn) 培養(yǎng)基的配制 1、培養(yǎng)基母液的配制 2、培養(yǎng)基的配制,一、培養(yǎng)基的成分,大量元素 微量元素 氨基酸和有機(jī)附加物 植物激素（植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑） 維生素類 凝固劑,大量元素（以Ms培養(yǎng)基為例）,微量元素（以MS培養(yǎng)基為例）,氨基酸和有機(jī)附加物（以MS培養(yǎng)基為例）,植物激素（植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）,1、生長(zhǎng)素類：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。 2、細(xì)胞分裂素類：KT，6-BA，ZT等。 3

7、、赤霉素類；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等 4、脫落酸：ABA 5、乙烯 6、PH值：5.6-5.8,培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn),按性質(zhì)分 基本培養(yǎng)基 ：MS、MT（Murashige and Tucher）White 完全培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 其它成分（激素、有機(jī)物質(zhì)等）,按狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基。 按作用分：誘導(dǎo)培養(yǎng)基；增值培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。 按培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基配方及特點(diǎn),參見課本p1718,培養(yǎng)基的配制,母液（儲(chǔ)備液）的配制與保存 培養(yǎng)基配制,Ms母液（儲(chǔ)備液）的配制與保存,培養(yǎng)基的配制,1、在潔凈的不銹鋼鍋里放入750

8、ml蒸餾水，加入所需要的瓊脂和糖，加熱熔化。 2、加入儲(chǔ)備液1，儲(chǔ)備液2、各，按需要量加入植物激素。 3、用蒸餾水定容到1L。 4、調(diào)H值。一般. 5、培養(yǎng)基的分裝。 6、包扎。 7、培養(yǎng)基的高壓滅菌。,培養(yǎng)基的滅菌,高溫高壓蒸汽滅菌：121，1.1Kg/c，15-20芬，時(shí)間過長(zhǎng)，培養(yǎng)基成分易變性失效 過濾滅菌：在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類,第三節(jié)：外植體的選擇與培養(yǎng),主要內(nèi)容：,外植體的選擇 外植體的滅菌 外植體的接種和培養(yǎng) 外植體的成苗途徑 污染的原因及預(yù)防措施 外植體的褐變及其防止措施 培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施,一、外植體的選擇,1、外植體（Explant）：是指植物離體培

9、養(yǎng)中的各種接種材料。包括植物體的各個(gè)器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。 2、外植體選擇的要求 選擇優(yōu)良的種質(zhì)：材料的選擇要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加實(shí)用性。 選擇健壯的植株：選取發(fā)育正常的器官或組織，再生能力強(qiáng)，組培易成功。,選擇合適的大?。焊鶕?jù)不同的植物而異，太大容易污染，太小，多形成愈傷組織甚至難于成活。一般在0.5-1.0cm之間。 選擇最適的時(shí)期：一般按植物生長(zhǎng)的最適時(shí)期選取材料,外植體的類型,1、莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限） 2、莖段（采用嫩莖的切段促進(jìn)腋芽萌發(fā)，取材容易） 3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產(chǎn)生植株

10、，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）； 4、花球和花蕾 5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。,二、外植體的滅菌,外植體的消毒是組培成功與否的第一關(guān)鍵步驟。 外植體的預(yù)處理：對(duì)外植體進(jìn)行修整,去掉不要的部分,在流水下沖洗干凈. 外植體的表面滅菌： 原則：充分滅菌，但不傷外植體；不同的外植體，滅菌的要求也不一樣,常用滅菌藥劑的使用和效果,常用的滅菌方法,(1)莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗-75%酒精浸泡10-20min-無菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min-無菌水洗3-4次 （2）果實(shí)和種子的消毒：自來水沖洗10-30min-70%酒精漂洗-2%Naclo液浸10min

11、-無菌水2-3次-取出種子培養(yǎng) （3）根及地下部器官的消互毒：自來水沖洗-純酒精漂洗-升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min-無菌水洗3次 （4）花藥的消毒：自來水沖洗 70%酒精浸泡數(shù)秒鐘-無菌水洗2-3次-漂白粉上清液浸10min-無菌水洗2-3次,消毒注意事項(xiàng),表面消毒劑對(duì)植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以減少組織的死亡。 在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。 與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，因?yàn)橄緞?huì)阻礙植物細(xì)胞對(duì)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。 若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1小時(shí)以

12、上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織培養(yǎng)。 HgCl2效果最好，但對(duì)人的危害最大，用后要用水沖洗至少5次。,三、外植體的接種和培養(yǎng),（一）外植體的接種-無菌操作,是將表面滅菌的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部過程。整過接種過程均需無菌操作。,外植體接種全過程,酒精擦拭手,外植體消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精燈灼燒,酒精擦拭培養(yǎng)皿,酒精擦拭,旋轉(zhuǎn)灼燒,取外植體,接種,蓋好瓶塞,修剪外植體,（二）外植體的培養(yǎng),1、光照 2、溫度 3、濕度 4、氧氣,愈傷組織途徑：,外植體的成苗途徑,如安祖花的組織培養(yǎng)就屬此類途徑,器官發(fā)生途徑：外植體經(jīng)誘導(dǎo)后直接形

13、成根和芽，進(jìn)而形成完整的植物體。如莖尖培養(yǎng)。,胚胎發(fā)育途徑：,50年代末期，Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養(yǎng)基通過游離細(xì)胞的分化，獲得了胚狀體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在植物組織培養(yǎng)中具有胚狀體分化能力的種子植物已達(dá)117種，分屬43科，75屬 。 培養(yǎng)基的激素成分和氮源影響胚狀體的發(fā)生。有的植物可在無激素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體，如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養(yǎng)；有的植物需要生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的一定比例誘導(dǎo)胚狀體，如油茶、酸棗、桃等。 在植物組織組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比較，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，一是數(shù)量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優(yōu)點(diǎn)，所以在育種工作及園藝工作中，可用胚狀體

14、作為特定的優(yōu)良基因型個(gè)體的無性繁殖手段，同時(shí)在研究胚胎發(fā)育中也有很重要的理論意義。,五、污染的原因及其預(yù)防措施,1、污染：植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材 料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象 2、污染的原因 一是病原菌污染（細(xì)菌、真菌） 二是外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌 三是操作人員未遵守操作規(guī)程。,真菌污染,污染的預(yù)防措施,組織培養(yǎng)中降低污染率是工廠化生產(chǎn)中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。預(yù)防措施有： 防止材料帶菌-選擇取材時(shí)間、材料與培養(yǎng)、外植體滅菌等措施； 防止用具帶菌-器皿與金屬器械滅菌； 操作室要處于無菌狀態(tài)-工作室、培養(yǎng)室滅菌等； 操作人員要按照操作程序進(jìn)行。 在培養(yǎng)基中加入抗菌素 分散接種,假設(shè)

15、污染率為95%： 100塊材料，接種于100支試管，即1塊/支。 得率為：P=（1-95%）100=5塊無菌材料 200塊材料，接種于100支試管，即2塊/支。 P1（2污）=95% 95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 95%5%=9.5% P3（2得）=5% 5%=0.25% 若得到1支試管的無菌材料，至少要接種： 1/0.25%=400支，即接種800塊材料，能得2塊無菌材料。 若按3塊/支接種，需做8000支試管培養(yǎng)基，接入2.4萬塊材料，才能有1支試管的（得3塊）無菌材料。,六、外植體的褐變及其防止措施,褐變,褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激后活，使細(xì)胞

16、內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會(huì)抑制其他酶的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現(xiàn)象,影響褐變的因素,植物種類：一般木本植物，單寧、色素含量高的植物易發(fā)生褐變 。 基因型： 外植體的生理狀態(tài)：一般幼齡材料，幼嫩器官和組織，春季取外植體，褐變發(fā)生較輕 。 培養(yǎng)基的成分：培養(yǎng)基中6BA或KT能促進(jìn)褐變發(fā)生，而生長(zhǎng)素類如IAA可減輕褐變發(fā)生。 材料轉(zhuǎn)移時(shí)間：,褐變的防止措施,選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基：適當(dāng)降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，降低PH值，降低細(xì)胞分裂素水平等，可顯著減輕培養(yǎng)物褐變 連續(xù)轉(zhuǎn)移 加抗氧化劑：如硫代硫酸

17、鈉、抗壞血酸； 加活性碳 加多胺類物質(zhì)，如精胺、亞精胺,七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施,玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因,培養(yǎng)物增殖培養(yǎng)時(shí)，若細(xì)胞分裂素濃度過高或細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相對(duì)含量高，培養(yǎng)基中離子種類，比例不適，瓊脂濃度低，不良培養(yǎng)環(huán)境如溫度過低或過高，光照時(shí)間過長(zhǎng)及通氣不良，易造成組培苗含水量高，莖葉透明，出現(xiàn)畸形，發(fā)生玻璃化現(xiàn)象,玻璃化現(xiàn)象的預(yù)防措施,適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度 適當(dāng)控制培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂濃度 適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度 增加自然光照，控制光照時(shí)間 控制好溫度 改善培養(yǎng)皿的氣體交換狀況 在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì),培養(yǎng)階段易出現(xiàn)的其他問題,白花苗,第四節(jié)：試管苗的馴化與移栽,主要內(nèi)容： 1、試管苗的特點(diǎn) 2、試管苗的馴化 3、試管苗的移栽 4、提高試管苗移栽成活率的途徑,試管苗