1、藥物分析課件,第十三章生物制品分析概論,基本要求,掌握：常用的定量分析方法中的色譜分析法。 熟悉:該類藥物的質量檢驗的基本程序與方法。 了解：生化藥物和基因工程藥物定義、種類和特點。,基本內容,一、概述 二、鑒別試驗 三、雜質檢查 四、含量（效價）測定 練習與思考,1、生物制品藥物分析有那些特點？ 2、為什么必須對生物制品進行全程質量控制？,問題,生物藥物 （來源和生產(chǎn)方法）,生化藥物 生物合成藥物 生物制品,第一節(jié) 概述,2005年版藥典分為幾部？每部的收載內容？,生物藥物,利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合運用生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學的原理與方法制得

2、的一大類藥物。,生物藥物發(fā)展過程：,第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質與混合成分的粗提取物制劑：魚肝油、胰酶及其腸溶、甲狀腺粉及其制劑等。,第二代：根據(jù)生物化學和免疫學原理，應用近代生化分離純化技術從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分。如：尿激酶、胰島素、人血白蛋白等。,第三代：應用生物工程技術生產(chǎn)的天然生理活性物質，以及通過蛋白質工程原理設計制造的具有比天然物質更高活性的類似物，或與天然物質結構不同的全新的藥理活性成分。如：重組人生長激素、重組人胰島素等。,生化藥物,定義： 指從動物、植物及微生物提取的，也可用生物-化學半合成或用現(xiàn)代生物技術制得的生命基本物質及其衍

3、生物、降解物以及大分子的結構修飾物等，如氨基酸、多肽、蛋白質、酶、多糖、脂質、核甘酸類。,生物合成藥物,定義: 由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉化反應共同完成的半合成藥物,如: 山梨醇、木糖醇、甘露醇、維生素、甾體激素、酶與輔酶類藥物等。,生物制品,定義 用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。包括：細菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、細胞因子、體內及體外診斷制品以及其他活性制劑 微生態(tài)制劑:雙歧桿菌,生物制品的種類和特點,根據(jù)所采用的材料、制

4、法或用途不同，可分為六類: 疫苗類藥物:人用狂犬病疫苗 抗毒素及抗血清類藥物:流感全病毒滅活疫苗;抗蝮蛇毒血清 血液制品:人血白蛋白 重組DNA制品 診斷制品 其他制品,由于有效結構或分子量不確定，其結構的確證很難沿用化學藥物或結構已知的生化藥物所常用的方法，還需要生物化學分析如：氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等。,大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質（如蛋白質、多肽、核酸、多糖類等）。組分相同，但相對分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性，因此常需進行相對分子量的測定。,（二）生物制品的特點,分子量不是定值。,生化法結構確證。,需檢查生物活性。,生物制品對熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏

5、感，各種理化因素的變化易對生物活性產(chǎn)生影響。特別是多肽和蛋白質。除理化分析，還需生物檢定，防止蛋白質失活。,要求安全性檢查。,生物制品組分復雜，有效成分濃度很低，生物大分子雜質含量比較高，生產(chǎn)工藝復雜，易引入特殊雜質和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括：細胞外源因子檢查、原液、半成品、成品中有關血清白蛋白殘留量、CHO細胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過敏試驗、異常毒性檢查等。,需做效價測定。,對于生物制品有效成分的檢測，除應有一般化學方法或理化分析進行有效成分含量測定外，更應根據(jù)產(chǎn)品的特異生理效應或專一化反應擬定其專屬性的生物效價測定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。 例：人凝

6、血酶原復合物的效價測定。,三、生物制品的全程質量控制,生物制品化學性質與生物學性質都很不穩(wěn)定，又易受微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應有嚴格要求，以生產(chǎn)出具有藥理活性高、針對性強、毒性低、副作用小，療效可靠及營養(yǎng)價值高等特點的安全、高效的生物制品。為此，必須進行原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的全程質量控制，以確保產(chǎn)品符合質量標準要求。,生物制品及檢定規(guī)程草案（1952年）,生物制品制造檢定規(guī)程（1959年）,中國生物制品規(guī)程（2000年）,中華人民共和國藥典三部（2005年）,收載生物制品101種,生物制品 品名 定義、組成及用途 基本要求 制造 檢定（原液、半成品、成品

7、） 保存運輸及有效期 使用說明（僅預防類含此項）,化學藥品 品名 化學結構、分子式 性狀 鑒別 檢查 含量測定,藥典三部各論內容,藥典二部各論內容,生物制品質量控制重點,有效成分的同一性、結構確證 有效成分的均一性、純度檢查 有害物質及殘余雜質等的控制 高效、靈敏的生物活性及比活性等實驗方法,生物制品質量控制基本方法： 鑒別試驗 雜質檢查 安全性檢查 含量測定（生物活性或效價）,第二節(jié) 鑒別試驗,依據(jù)生物制品的化學結構、理化性質和生物學特點，利用化學法、物理法及生物學方法進行某些特殊反應，或測定某些專屬的理化常數(shù)如紫外吸收系數(shù)、等電點、電泳遷移率、色譜保留時間和肽圖等，判斷與確證產(chǎn)品的真?zhèn)?。?/p>

8、一組實驗）,一、理化鑒別法,1、化學鑒別法 利用藥物與某試劑在一定條件下反應，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進行鑒別。如胰島素的沉淀反應。 2、紫外分光光度法 蛋白質生物制品主要由芳香族氨基酸側鏈如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸產(chǎn)生紫外吸收。如重組人促紅素最大吸收279nm。 3、高效液相色譜法 （主峰保留時間和肽圖的一致性） 例如重組人粒細胞集落刺激因子的肽圖分析,二、生化鑒別法,1、酶法 利用酶對底物特異性的催化活力，做為酶類生物制品簡便、快速鑒別方法。 如尿激酶的鑒別,2、電泳法 等電點聚焦電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等?？捎糜诘鞍踪|類生物制品的鑒別。,三、 生物鑒別法,（一）血清學法-體外抗原抗體

9、試驗 抗原抗體類生物制品的鑒別 抗原抗體在體外結合時，可因抗原物理性狀不同或參與反應的成分不同而出現(xiàn)各種類型的反應，如凝集反應、沉淀反應、中和反應和補體結合反應，即經(jīng)典血清學反應，在此基礎上，又衍生出免疫擴散、免疫電泳、熒光標記、酶標記等高度敏感的檢測技術。,（二）生物學法,利用生物體對生物制品特定的生物活性的反應為基礎進行供試品的鑒別。 例如: 小鼠驚厥試驗鑒別胰島素 肝素延長血凝鑒別肝素,第三節(jié) 雜質檢查,可用來判斷藥品的優(yōu)劣。由于生物制品來自生物體，生物活性特異性強，制造與純化工藝復雜，分子結構常常不確定，有時產(chǎn)品并非單一，極微量雜質可能產(chǎn)生顯著的效應，因此，其雜質檢查顯得尤為重要。 主

10、要包括： 一般雜質檢查 特殊雜質檢查 安全性檢查,一般雜質檢查 氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度、溶液的顏色、水份及干燥失重、熾燒殘渣等。,一、特殊雜質檢查,從原料中帶入或生產(chǎn)工藝中或貯藏過程中引入的雜質 根據(jù)生物制品的生產(chǎn)工藝特點與產(chǎn)品的穩(wěn)定性，其特殊雜質分為： 生物污染物：微生物污染、宿主細胞蛋白、外源性DNA、培養(yǎng)基成分等 產(chǎn)品相關雜質：二聚體和多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、裂解產(chǎn)物等 工藝添加劑：殘余抗生素、蛋白分離劑聚乙二醇、乙醇、佐劑氫氧化鋁，產(chǎn)品穩(wěn)定劑如辛酸鈉、肝素，防腐劑苯酚、硫柳汞，細菌與病毒滅活劑甲醛、戊二醛等。,（一）宿主細胞蛋白殘留量測定

11、,生物制品生產(chǎn)用細胞、工程菌相關的特殊雜質。 目的：控制異源蛋白含量以防超量后引起機體免疫反應 測定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法ELISA,（二）外源性DNA殘留量的檢查,測定方法： 分子雜交技術 基于DNA結合蛋白分析系統(tǒng) 實時定量PCR方法,（三）產(chǎn)品相關雜質檢查,生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存過程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結構類似的同系物、異構體、突變物、氧化物、聚合體或降解物。 常用HPLC法和電泳法。 如重組人生長激素中相關蛋白質的測定 總相關蛋白質含量不超過10%。,（四）殘余抗生素的檢查,如果生物制品在生產(chǎn)過程中使用了抗生素，則不僅要在純化工藝中除去，而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性

12、的檢測方法。 常用方法：抑菌圈測量。 結果判定：對照溶液有抑菌圈，陰性對照無抑菌圈，供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照溶液抑菌圈的直徑時判斷為陰性；否則為陽性。,二、安全性檢查,（一）熱原檢查法和細菌內毒素檢查 法 （二）異常毒性檢查 （三）過敏試驗 檢查異性蛋白 （四）降壓試驗 檢查組胺、類組胺或其他導致血壓下降的物質 （五）無菌試驗 檢查藥品及敷料是否有活菌的一種方法,含量測定,HPLC SDS-PAGE,效價測定,第四節(jié)：含量（效價）測定,常用的定量分析方法及應用,理化分析法 生化分析法 生物檢定法,理化分析法,化學分析方法 電化學分析法 光譜分析法 色譜分析法,重量法 容量分析法,比色法,

13、利用樣品與顯色劑發(fā)生現(xiàn)色反應，根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色強度來測定含量。Elson-Morgan,硫酸軟骨素的比色法測定：在酸性條件下使樣品水解成氨基己糖，再在堿性條件下與乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反應生成紅色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在525 nm處有最大吸收。,光譜分析方法,具體試驗操作： 1、制備對照品溶液鹽酸氨基葡萄糖 2、制備供試品溶液硫酸軟骨素 3、反應和測定縮合反應和比色測定,A平為供試品溶液的吸收度 As平為對照品溶液的吸收度 Ws為對照品溶液的濃度（mg/ml） W為稱樣量（mg） 0.8309為校正因子 500為稀釋倍數(shù),以氨基葡萄糖計24.0,高效液相色譜法,反相高效液相色譜法 RP-HPLC

14、 Reversed-phase high-performance liquid chromatography 高效離子交換色譜法 HPIEC High-performance Ion-exchange chromatography 高效凝膠過濾色譜法 HPGFC High-performance Gel-filter chromatography,反相高效液相色譜法,基本原理：利用ODS或C18等極性較小的鍵合硅膠為填料，以極性較大的methanol-water、CH3CN-H2O為流動相，根據(jù)樣品在固定相和流動相中的不同保留行為而實現(xiàn)高效分離的一種方法。,可以應用UV、DAD、FD、ELSD

15、、ECD、MS等作為檢測器，分離化合物范圍廣泛。,生白能（重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子）的RP-HPLC測定,色譜條件 色譜柱：TSK ODS-120T(1504.6 mm, I.D.,5m) 流動相:（A）0.1的三氟乙酸,（B）乙腈1三氟乙酸（90：10），梯度洗脫 檢測波長：214 nm 柱溫：室溫 流速：1.0 ml/min,重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子（GM-CSF),添加劑(人血白蛋白）,生白能的HPLC圖,高效凝膠過濾色譜法,根據(jù)生物藥物的分子量及其極性來對成分進行分離測定，主要用于生化藥物的分離和分子量的測定研究。 分離產(chǎn)物可以回收、可以用少量表面活性劑來改善分離效果、可根據(jù)化

16、合物的形狀和分子量大小來預測出峰順序。 具有簡便、快速、重現(xiàn)性好、樣品用量少等優(yōu)點。,HPGFC法測定重組人腫瘤壞死因子（rh-TNF）衍生物的分子量,色譜條件 色譜柱：Beckman SEC 3000 (3007.5 mm) 流動相:0.1mmol/lKH2PO4:0.1mmol/lNa2SO4(1:1) 檢測波長：280 nm 柱溫：室溫 流速：1.0 ml/min,Standards: 醛縮酶-2、血清白蛋白-3、碳酸肝酶-4、抑蛋白酶肽-5 Inter standard（IS）:右旋糖酐藍-1、酪氨酸-6,二、生化分析法,（一）酶法,酶法 酶活力測定法以酶為分析對象 酶分析法以酶為分析

17、工具或分析試劑 酶活力測定法 酶催化一定化學反應的能力。測定一個被酶所催化的化學反應速度。酶反應速度以單位時間底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。,酶活力,酶促反應的影響因素,（1）底物濃度的影響：選擇Km小的作底物 （2）pH的影響 （3）溫度的影響：溫度控制在0.1度 （4）輔助因子的影響 （5）空白和對照試驗 空白：雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量 對照實驗：用純酶或標準酶制劑測定。用 于比較或測定的標準。,酶法測定方法,（1）取樣測定法 停止酶反應的方法：添加變性劑 加熱使酶失效 （2）連續(xù)測定法,檢測方法,1、UV-VIS根據(jù)產(chǎn)物和底物特征吸收 差別 2、熒光 3、旋光法 4、酶偶聯(lián)測定法

18、例如：ELASA 5、其他：電化學法、離子選擇電極測定等,酶分析法,以酶為分析工具的方法。分析的對象可以是酶的底物、輔酶活化劑或酶抑制劑。 影響因素：酶和作用物的濃度、反應時間、溫度和pH,（二）電泳法,生物制品藥物分析的重要手段。 在電解質溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移。 1、自由界面電泳 2、區(qū)帶電泳:紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、PAGE、SDS-PAGE。 3、HPCE：CZE、MECC、CGE、CIEF,電泳原理,電泳分類,常用電泳法的類型和應用,1、紙電泳法： （1）操作方法； （2）定量方法：同紙色譜 （3）應用：蛋白質、核苷酸類,2、醋酸纖維素薄膜電泳,應用：血清蛋白、脂蛋白等的分離測定 3、PAGE法 聚丙烯酰胺凝膠，分離效果取決于分子所帶電荷與分子大小的比例及分子篩效應。 4、SDS-PAGE法 測定酶和蛋白等大分子物質分子量，蛋白分子相對遷移率的大小完全取決于分子量