1、miRNA的作用機制及功能研究進(jìn)展王娟（德州學(xué)院生物系，山東德州 253023）摘要 microRNA (miRNA)是內(nèi)源性的大小在20-25nt的一類非編碼RNAs，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性的功能，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，并在進(jìn)化中保守。miRNA的廣泛存在與進(jìn)化上的保守性，暗示它在生命活動中具有必不可少的調(diào)節(jié)作用，他們參與動植物生長發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與調(diào)亡、激素分泌、腫瘤形成等各種過程。本文總結(jié)了近幾年來在miRNA的特征、生物發(fā)生、作用機制及功能意義上的研究進(jìn)展。miRNA無論在數(shù)量上還是功能上，可能都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前的發(fā)現(xiàn)，對其進(jìn)行深入的研究，將有助于我們對生物體的各種生理病理機制的理

2、解，并最終為疾病的診斷和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 siRNA； microRNA； piRNA; 微處理器; 核糖核酸內(nèi)切酶; 基因調(diào)控; 生長發(fā)育； 腫瘤治療前言2006年，Andrew Fire 和Craig Mello 由于在RNAi（RNA interference，RNAi）及基因沉默現(xiàn)象研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎，這再次將人們的注意力拉到siRNA這樣一種小分子RNA上。小分子RNA包括一個大家族，并在真核生物中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能。目前已經(jīng)有至少兩種小分子RNA被描述：來源于發(fā)夾狀前體的miRNAs (microRNAs)和由長的dsRNAs加工而來的siRNA

3、s (small interfering RNAs)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與siRNA有很多相似之處，但也有很大的不同，二者的區(qū)別將在以下文中進(jìn)行論述。最近又有文章報道了一種新的小分子RNA的發(fā)現(xiàn)25piRNAs (piwi-interacting RNAs),他們特異地在小鼠的生精細(xì)胞中大量表達(dá)。這些RNAs比以前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)小RNAs較大，約2631nt(nucleotides)，并與Argonaute蛋白家族的Piwi亞枝(Piwi-subclade)成員相聯(lián)系。 Argonaute 蛋白大約100KD，具有PAZ (Piwi Argonaut and Zwille)和PIWI結(jié)構(gòu)域。一

4、種小RNA分子引導(dǎo)Argonaute蛋白識別靶分子并介導(dǎo)基因沉默。Argonaute家族被分為Ago和Piwi兩個亞枝。一般，Ago成員廣泛存在并與miRNAs 和siRNAs有關(guān)，而Piwi成員則限制在種系細(xì)胞和干細(xì)胞中表達(dá)。 克隆的piRNAs 在染色體中表現(xiàn)出極不均勻的分布，大多數(shù)piRNAs簇集于染色體中相對較小的基因座位，大小約1 kb到100 kb包含104500個小RNAs。盡管目前對這些RNAs的生物發(fā)生和功能還不清楚，但這些發(fā)現(xiàn)為小RNA生物學(xué)和種系細(xì)胞生物學(xué)增加了新的內(nèi)容。本文將重點論述miRNA的最新研究進(jìn)展，miRNA自被發(fā)現(xiàn)，迅速成為近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。對它

5、的研究將會對轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)領(lǐng)域的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。miRNA是一類長度約為22nt的小分子非編碼單鏈miRNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體（pre-miRNA）加工而來，能夠和互補或部分互補的靶mRNA的3末端非翻譯區(qū)(3untranslationalregion,3UTR)結(jié)合，使mRNA降解或介導(dǎo)其翻譯抑制。miRNA家族的成員是在研究秀麗線蟲的發(fā)育轉(zhuǎn)變過程中作為小分子短暫RNA（stRNA）被發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是stRNA中的一個大家族，并且在線蟲、果蠅、植物、哺乳動物、甚至病毒中均有發(fā)現(xiàn)。這類小RNA在表達(dá)上具有組織和時間的特異性，是調(diào)節(jié)其他功能基

6、因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)分子，在生物體的各種生命活動過程中發(fā)揮著重要作用。1 miRNA的發(fā)現(xiàn)及命名早在1993年Lee等20利用遺傳分析的方法已經(jīng)在線蟲中發(fā)現(xiàn)一個22nt的小分子非編碼RNA:lin-4。Lee等注意到，lin-4或lin-14突變后造成線蟲發(fā)育差時表型(heterochronic phenotype)，在線蟲發(fā)育早期起作用的lin-4基因的突變使線蟲中應(yīng)該在早期出現(xiàn)的發(fā)育事件延遲發(fā)生，而lin-14基因的缺失突變卻造成了完全相反的結(jié)果。后來證明，這種lin-4基因編碼的約22個核苷酸的單鏈RNA通過不完全互補的方式結(jié)合到靶mRNA(target mRNA)lin-14的3末端非翻譯

7、區(qū)(3untranslationalregion，3UTR)，短暫下調(diào)lin-14蛋白的水平，促使線蟲從L1期向L2期的過渡，但并不影響mRNA的水平。2000年Reinhart等22發(fā)現(xiàn)了另一個類似的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA:let-7。第二個miRNA let-7的發(fā)現(xiàn)掀起了尋找miRNA的熱潮，擬南芥、線蟲、果蠅、小鼠、以及人類等各種生物及病毒中都相繼有miRNA的報道,且主要以模式生物為主。miRNA種類的普遍性及多樣性預(yù)示著它在生物界中具有更廣泛的功能。miRNA的命名，除最早發(fā)現(xiàn)的幾種miRNA（如：lin-4 和let-7等）以外，其他發(fā)現(xiàn)的都用“miR-#”來表示12，

8、“#”為阿拉伯?dāng)?shù)字（如miR-1，miR-2），對應(yīng)的基因也用這三個字母后綴加數(shù)字命名，具體根據(jù)不同物種的命名習(xí)慣采用連字符、斜體或大寫（如線蟲和果蠅中的mir-1，水稻和擬南芥中的MIR-156）。2 miRNA的特征及與siRNA的比較2.1 miRNA的特征 2.1.1 結(jié)構(gòu)特征 長度為22nt是miRNA一個最基本的特征, 且具有能形成分子內(nèi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體。在動物中,前體的長度一般在7090nt,而在植物中前體的長度可變性很大,可以從幾十到數(shù)百nt。2.1.2 miRNA的存在形式 miRNA基因常以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中, 在基因組中有固定的基因座位，7090

9、位于蛋白基因的基因間隔區(qū)(intergenic region,IGR)，其余在內(nèi)含子，還有個別在編碼區(qū)的互補鏈，說明它們的轉(zhuǎn)錄獨立于其他的基因,具有本身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。最近有研究21發(fā)現(xiàn)，25%的人類已知miRNA位于蛋白質(zhì)編碼基因的基因內(nèi)區(qū)域(intronic regions)，其中大約50%定位于內(nèi)含子(introns)中,這些miRNA都具有獨立的轉(zhuǎn)錄單元，可以作用于其主基因(host gene)的非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)下調(diào)其蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)水平，并且還可以作為重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)子。2.1.3 保守性 miRNA不僅在結(jié)構(gòu)上保守而且在物種間具有高度的

10、進(jìn)化保守。結(jié)構(gòu)上，miRNA 在頸部的保守性較強，而環(huán)部可以容納較多的突變位點的存在。種系上，有些miRNA在一些物種中是高度保守的。約12的miRNA在線蟲、果蠅、哺乳動物和植物中呈現(xiàn)保守性，經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)，這些保守片斷的堿基差異僅為12 nt；miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎動物和脊椎動物中高度保守。在線蟲中,發(fā)現(xiàn)85 %的miRNA 在C. briggsaze 基因組序列中是有同源物的18。最具有miRNA保守性的是let-7 RNA,let-7在C. elegans和人類中完全保守；大約40的C. elegans中的miRNA在人類中也是保守的。線蟲C.elegans中的

11、let-7 miRNA可以在果蠅基因組,人的第9、11和22條染色體上各找到一個與之完全一致序列,另外在人的第9條染色體上還有一個僅差1個核苷酸的序列10。2.1.4 時空特異性 目前研究較清楚的lin-4與let-7呈時間特異性表達(dá)。在C.elegans中，lin-4只在幼蟲的第一期和第二期存在;let-7卻存在第三、第四期及成蟲期,在第一和第二期并不存在；在擬南芥中，miR157在幼苗中高表達(dá)，miR171則在花中高表達(dá)23。同時,miRNAs的表達(dá)具有組織特異性。例如，mir-290mir-295只在鼠胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，而在成體組織主要在胸腺和骨髓中表達(dá)14。最近一項研究28發(fā)現(xiàn)，miR

12、NA靶目標(biāo)在成熟小鼠和果蠅組織中的表達(dá)水平要比在胚胎中低，同時，miRNA更傾向于靶向廣泛表達(dá)的而不是組織特異性表達(dá)的基因，這項結(jié)果表明了miRNA廣泛地參與胚胎發(fā)育及成體組織特性的維持。2.2 miRNA與siRNA的比較miRNA與siRNA 的根本區(qū)別是他們來源不同，而二者的作用機制相通。首先，miRNA與siRNA之間有許多相同之處：1.二者的長度都約在22nt左右。2.二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點: 5端磷酸，3端均有2個游離核苷酸。3. miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。4. 二者都是RISC(RNA

13、induced silencing complex)組分，都具有組成RISC復(fù)合體的Argonaute蛋白家族，其功能界限已變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機制上有重疊。miRNA和siRNA也有區(qū)別。1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，在基因組中有固定的基因座位；siRNA可以是人工體外合成的，也可以是基因組的轉(zhuǎn)錄片斷，降解片斷和轉(zhuǎn)座片斷，病毒基因組轉(zhuǎn)錄片斷等，關(guān)鍵在于siRNA沒有固定的基因座位，本身不是基因組的功能片斷，是隨機產(chǎn)生的，即加工位點不是保守的。2.二者結(jié)構(gòu)上沒有本質(zhì)區(qū)別，功能分子都是單鏈RNA，miRNA轉(zhuǎn)錄出來時必然是發(fā)夾狀的，siRNA可以由完全互補的雙鏈切斷而來，也可以從發(fā)夾

14、來。3.本質(zhì)區(qū)別在于作用位點上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位點，一般在靶基因3-UTR區(qū)，而siRNA由于是隨機產(chǎn)生的或者人工設(shè)計的，因此作用位點可以設(shè)計或改變，可作用于mRNA的任何部位。4.在作用方式上，沒有本質(zhì)區(qū)別，是否降解或翻譯抑制取決于互補程度，siRNA也可抑制靶標(biāo)基因的翻譯。5.miRNA的生理功能在于調(diào)控發(fā)育分化和調(diào)亡，適時調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，而siRNA是生物抵抗外來核酸片斷入侵的一種方式，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。miRNA與siRNA 的區(qū)別總結(jié)于表12。表1 miRNA和siRNA的區(qū)別 特性 miRNA siRNA 來源 內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本 轉(zhuǎn)基因、病

15、毒RNA大小 約22nt 約22nt前體 莖環(huán)狀的pre-miRNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA催化酶 Drosha、Dicer或類似 DicerDicer的酶復(fù)合體RISC復(fù)合體 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族匹配方式 不完全互補（動物）或 完全互補 完全互補（大多數(shù)植物）作用目標(biāo)的專一性 相對較低 高 (特異性)續(xù)表1 特性 miRNA siRNA作用點 蛋白質(zhì)合成水平 轉(zhuǎn)錄后水平靶基因的命運 抑制轉(zhuǎn)錄或者被降解 被降解功能 發(fā)育過程中調(diào)節(jié) 抑制轉(zhuǎn)錄活性、病毒 內(nèi)源基因的表達(dá) 感染、表型遺傳3 miRNA的生物發(fā)生 目前，關(guān)于miRNA的生物發(fā)生的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展

16、。動物(尤其是人) miRNA 的生物合成過程已經(jīng)初步得到了詮釋。miRNA的生物發(fā)生過程如圖14所示。圖1 miRNA的生物發(fā)生過程3.1細(xì)胞核中miRNA基因的轉(zhuǎn)錄與加工 大多數(shù)miRNA是由基因間DNA序列編碼的,轉(zhuǎn)錄方向與相鄰的基因往往相反,被認(rèn)為是與基因表達(dá)不同的獨立單位。基因組DNA在RNA聚合酶的作用下產(chǎn)生原始miRNA轉(zhuǎn)錄本(primary transcripts, Pri-miRNA)。Pri-miRNA在5端具有甲基化的鳥嘌呤,而3端具有多聚腺嘌呤堿基。另外一類miRNA是位于基因的內(nèi)含子中,并會隨著信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄,包含在mRNA的前體中。這一類miRNA的轉(zhuǎn)錄

17、方向是和對應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄方向一致的,因此一般認(rèn)為此類miRNA的表達(dá)和對應(yīng)的mRNA一樣具有組織特異性11。pri-miRNA在一種叫做微處理器的復(fù)合體的作用下，剪切為約70個核苷酸長度，一端5磷酸，一端3端兩個懸垂，且具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體(precusor of miRNA,pre-miRNA)。細(xì)胞核中的微處理器在不同的生物體中，所包含的成分不盡相同。在線蟲、果蠅及哺乳動物體內(nèi)，該復(fù)合體至少包含有兩種蛋白質(zhì)成分，分別為Drosha和Pasha(Partner of Drosha)。Drosha的主要作用是剪切pri-miRNA形成3端2nt懸垂的pre-miRNA，Pasha為

18、dsRNA結(jié)合蛋白，參與Drosha對底物的識別6。在人類，Pasha又稱為DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因8(DGCR8)。對DGCR8的研究結(jié)果顯示, DGCR8是由染色體22q11. 2的一個基因編碼,對miRNA在發(fā)育過程中有重要調(diào)節(jié)作用。3.2 pre-miRNA的出核轉(zhuǎn)運在最初的剪切后，pre-miRNA在Ran-GTP 依賴的核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白Exportin 5 的作用下，從核內(nèi)運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。Exportin 5與Ran-GTP 以及pre-miRNA形成異三聚體，通過核孔到達(dá)胞漿，然后，Ran-GTP轉(zhuǎn)變?yōu)镽an-GDP，釋放pre-miRNA。3.3 細(xì)胞質(zhì)中miRN

19、A的成熟一旦pre-miRNA被運送到細(xì)胞質(zhì)中,第二種RNA內(nèi)切酶,稱為Dicer(雙鏈RNA專一性RNA內(nèi)切酶),對莖環(huán)前體一端5磷酸，一端3端兩個懸垂的結(jié)構(gòu)有特殊親和力，在Dicer進(jìn)一步的作用下，miRNA前體被剪切成2125個核苷酸長度的雙鏈miRNA。起初，成熟miRNA 與其互補序列互相結(jié)合成所謂miRNA:miRNA* 雙螺旋結(jié)構(gòu)(miRNA* 是miRNA 的互補序列); 隨后，在解旋酶的作用下，雙螺旋解旋，其中一條結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非對稱RISC復(fù)合物(asymmetric RISC

20、 assembly)。該復(fù)合物會結(jié)合到目標(biāo)靶mRNA上，從而引起靶 mRNA 的降解或者翻譯抑制。在miRNA miRNA*雙螺旋中，只有其中一條單鏈可以選擇性結(jié)合到RISC上去而成為成熟miRNA，然后另一條立即被降解。盡管從理論上來說成熟miRNA的產(chǎn)生是隨機選擇的結(jié)果，但由于兩條鏈的穩(wěn)定性有所不同，導(dǎo)致機會的不等。如圖23所示miRNA miRNA*雙螺旋結(jié)構(gòu)中兩條鏈的3端均有2個游離核苷酸。此外，它的兩條鏈?zhǔn)遣煌耆珜ΨQ的：miRNA鏈上靠近5端有一個不與miRNA*鏈相應(yīng)位置配對的小突起。這個小突起顯著地減弱了miRNA 5端的穩(wěn)定性。由于成熟的miRNA產(chǎn)生總是趨向于選擇更不穩(wěn)定的5

21、端，因此miRNA鏈被選中的機會要大大多于miRNA*鏈(大約100倍)。結(jié)果往往是雙鏈解開后miRNA鏈結(jié)合到RISC中以做靶識別,而miRNA*則被迅速降解。這樣極度不對稱的選擇性的好處是，不會因為miRNA*鏈結(jié)合到RISC中的比例過多而顯著降低miRNA對翻譯的抑制效率3。圖2 miRNA miRNA*雙螺旋結(jié)構(gòu)示意圖由上可知，miRNA成熟過程中的連續(xù)加工，需要至少兩種核糖核酸內(nèi)切酶-（RNAase）：Drosha和Dicer催化，兩者都是特定dsRNA的RNA內(nèi)切酶。近年來對核糖核酸內(nèi)切酶-8的研究也有了一定進(jìn)展。 核糖核酸內(nèi)切酶家族依據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)域的組成不同，可以分為3個種類。第

22、一類包括一個保守的核糖核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域(RNasedomain,RD)和一個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRNA binding domain,dsRBD)，在細(xì)菌和酵母中有發(fā)現(xiàn)。如E.coli中的核糖核酸內(nèi)切酶-。第一類除了參與rRNA前體的加工成熟過程以外,還參與mRNA、tRNA前體的加工成熟過程。體內(nèi)外實驗都證明,無論是外源性還是內(nèi)源性的dsRNA,均可以被機體的核糖核酸內(nèi)切酶識別并且進(jìn)行切割,產(chǎn)生約為1215個核苷酸長度的siRNA。此siRNA的特點是5端有磷酸基團,3端有羥基基團,并且3端突出23個核苷酸長度, 5端凹陷。由核糖核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的siRNA與機體內(nèi)的一些酶等輔助因子形成

23、蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物,即為RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。在RISC的指導(dǎo)下,siRNA中的反義鏈尋找與其同源的mRNA區(qū)域,并且在RISC內(nèi)的核酸內(nèi)切酶的作用下降解同源mRNA,使相應(yīng)基因封閉。第二類包括2個RD(Ra和Rb)和1個dsRBD，如Drosha及其同源物，僅在動物細(xì)胞中有發(fā)現(xiàn)。Drosha定位于細(xì)胞核內(nèi),可以識別核內(nèi)的pri-miRNA并將其切割成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu),約含有70個核苷酸長度的miRNA前體(pre-miRNA),然后通過轉(zhuǎn)運蛋白exportin-5,結(jié)合形成exportin-5、Drosha、pre-miRNA的蛋白-RNA復(fù)合物,將pre-miRNA 由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運

24、至細(xì)胞質(zhì)。第三類如Dicer及其同源物，廣泛存在于原核、真核及植物當(dāng)中,由多個結(jié)構(gòu)域組成，除了有2個RD(Ra和Rb)和1個dsRBD外，還有1個長的N末端，此末端中含有1個DExH RNA螺旋酶/ATP酶結(jié)構(gòu)域、DUF283結(jié)構(gòu)域和PAZ結(jié)構(gòu)域, 這種酶可以和含有PP結(jié)構(gòu)域(PAZ Piwi domain,PPD)的蛋白質(zhì)相互作用。這種核糖核酸內(nèi)切酶-在真核細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞質(zhì)中,分散地分布于核糖體上,并且參與miRNA的加工成熟過程。它可以識別具有莖-環(huán)樣結(jié)構(gòu)約含有70個核苷酸長度的pre-miRNA,并且對其進(jìn)行切割產(chǎn)生成熟miRNA。4 miRNA的作用機制 miRNA在發(fā)揮作用之前，需

25、要同細(xì)胞內(nèi)一些協(xié)同因子結(jié)合形成蛋白質(zhì)- RNA復(fù)合物（miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP），在miRNP的作用下指導(dǎo)其識別同源mRNA。在Hela細(xì)胞裂解液中發(fā)現(xiàn)這類核糖核酸蛋白復(fù)合物的大小在15S左右，其主要成分為Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成員eIF2C2因子,后兩種蛋白質(zhì)與運動神經(jīng)元的存活(survival of motor neurons,SMN)有關(guān)10。研究認(rèn)為，miRNP即為RISC.miRNA與靶mRNA作用的典型方式主要有兩種(如圖3，圖416)：在大多數(shù)情況下(例如在動物中)，復(fù)合物中的單鏈miRNA

26、 與靶mRNA的3 UTR不完全互補配對，阻斷該基因的翻譯過程，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種方式只影響蛋白表達(dá)水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。目前，該翻譯抑制的詳細(xì)機理尚不清楚。最近有研究對此提出質(zhì)疑，他們24認(rèn)為，正常衰退途徑引起的mRNA降解速度的升高也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)水平的下降，且miRNA不僅能作用于翻譯起始后的延長階段，還能夠抑制翻譯的起始。被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞漿中被稱為P-bodies的區(qū)域，這個區(qū)域還濃縮了許多參與mRNA降解的酶類。然而，P-bodies可能是作為未翻譯mRNA進(jìn)行暫時的可逆儲存的容器，并且，減少一些特定P-body組成蛋白的表達(dá)能夠緩和mi

27、RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制。P bodies13 是胞漿中的一定區(qū)域(如圖3)，它包含參與多種轉(zhuǎn)錄后過程的蛋白質(zhì)，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、無義介導(dǎo)mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay ,NMD)，轉(zhuǎn)錄抑制及RNA介導(dǎo)的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。盡管P bodies不是介導(dǎo)基因沉默所必需的，但阻斷siRNA或miRNA基因沉默途徑的任何一步都會阻礙P-body的形成，這表明P-body是基因沉默的結(jié)果。因此，盡管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但P-body中的這種聚集并不

28、是介導(dǎo)基因沉默機制所必需的，而只能作為他們活動的結(jié)果。圖3 P bodies的作用機制另一種作用方式是，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補配對時，引起目的mRNA在互補區(qū)的特異性斷裂，從而導(dǎo)致基因沉默，這種作用方式與 siRNA類似。如大多數(shù)植物在可讀框(ORF)中與它的靶位點幾乎完全配對。這種mi/siRNA介導(dǎo)的基因沉默機制已得到了相關(guān)的闡釋。以siRNA參與的RNAi為例進(jìn)行說明，siRNA可與RISC結(jié)合,作為模板識別mRNA靶子，通過堿基互補配對原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結(jié)合，置換出正義鏈。雙鏈mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產(chǎn)生22nt左右的siRNA，siR

29、NA繼續(xù)同RISC形成復(fù)合體，與siRNA互補的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。這個過程也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對程度有關(guān)。MiRNA與目的基因配對不完全時，miRNA就以抑制目的基因的表達(dá)方式作用；miRNA與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。圖4 miRNA的兩種作用機制這兩種作用機制是最早被發(fā)現(xiàn)和熟知的，除此之外，近期，PNAS刊載一項最新的發(fā)現(xiàn)：快速脫腺苷酸化(accelerated deadenylation)是 miRNA 抑制基因表達(dá)的新機制26。Wu 等以miR

30、-125b 和 let-7 兩種代表性的miRNA為研究對象，在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)它們能夠促進(jìn)mRNA 聚腺苷酸尾巴 (polyA tail)的去除。他們認(rèn)為miRNA去除聚腺苷酸尾巴的能力不是由于降低翻譯水平或需要poly(A)為存在的翻譯抑制。為證明這點，Wu 等用 3組蛋白莖-環(huán)結(jié)構(gòu)取代聚腺苷酸尾巴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不但可以消除 miR-125b 對 mRNA 含量的影響，還可以降低對蛋白質(zhì)合成的作用。由此可知，miRNA 通過降低翻譯效率和聚腺苷酸化 mRNA 的濃度來抑制基因表達(dá)遠(yuǎn)比阻遏翻譯強而全面，而且，不像翻譯阻遏那樣導(dǎo)致 mRNA 的解體是不可逆轉(zhuǎn)。總之，miRNA 與靶mRNA 不完

31、全互補后有兩種轉(zhuǎn)錄后作用機制，除了阻遏翻譯外還可引起mRNA 快速脫腺苷酸化而被降解以抑制基因表達(dá)。對 miRNA作用機制的不斷深入研究不僅在理論上豐富了我們對基因調(diào)控的認(rèn)識，miRNA應(yīng)該具有潛在的多種調(diào)節(jié)基因表達(dá)方式，這還有待于實驗技術(shù)的進(jìn)步和人們的進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。5 miRNA 的功能及意義高等真核細(xì)胞中，miRNA基因占已知基因的1%，目前估計哺乳動物細(xì)胞中有600多個miRNA，30%的基因要受到miRNA的調(diào)節(jié)。miRNA的多樣性與進(jìn)化保守性決定了其在生理生化功能上的重要性與普遍性。然而只有少數(shù)miRNA的已經(jīng)明確，許多miRNA的功能還尚待深入研究。表21列出了幾種已知功能的miRN

32、A，現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識到這類小分子miRNA在生物體發(fā)育、細(xì)胞增值與分化、激素分泌、腫瘤形成等過程中扮演者重要角色。表2 已知功能的miRNA miRNA名稱 物種 生物學(xué)功能 靶基因lin-4 線蟲 發(fā)育時序調(diào)節(jié) lin-14,lin-28let-7 線蟲 發(fā)育時序調(diào)節(jié) lin-41,hbl-1lsy-6 線蟲 神經(jīng)細(xì)胞化學(xué)感受器 cog-1 不對稱性調(diào)節(jié)miR-273 線蟲 神經(jīng)細(xì)胞化學(xué)感受器 die-1不對稱性調(diào)節(jié)miR-165/166 擬南芥 葉子近軸與離軸細(xì)胞的分化 PHV/PHBmiR-172 擬南芥 花朵發(fā)育 APETALA2(AP2)Bantam 果蠅 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡 hidmi

33、R-14 果蠅 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和脂類代謝 caspase Ice?續(xù)表2miR-15a/ 哺乳動物 B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病 Bcl-2miR-16-1 （BCLLs）miR-196 哺乳動物 脊椎動物發(fā)育 Hox-B8miR-143 哺乳動物 脂肪細(xì)胞分化 erk5miR-375 哺乳動物 胰島素分泌調(diào)節(jié) mtpn miR-1 哺乳動物 心臟細(xì)胞的生長和分化 Hand25.1 miRNA與生物體的發(fā)育分化在動物中，針對數(shù)種模式生物(人、小鼠、果蠅、線蟲)的miRNA所做的研究已經(jīng)非常深入。在線蟲中除了最早發(fā)現(xiàn)的lin-4、let-7參與線蟲的形態(tài)轉(zhuǎn)換,還發(fā)現(xiàn)兩個與神經(jīng)模式發(fā)生有關(guān)的miRNA:

34、lsy-6和mir-273, 證據(jù)已經(jīng)表明,lsy-6和mir-273能影響左右神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)某一特定化學(xué)感受器受體的水平,這部分解釋了神經(jīng)系統(tǒng)功能的非對稱性7。另外，研究發(fā)現(xiàn)另一種重要的發(fā)育相關(guān)基因miR-196和靶基因Hox-B8匹配的非常完美，并導(dǎo)致靶mRNA的降解。在植物中，大多數(shù)的miRNA 介導(dǎo)其靶mRNA的降解。植物中的miRNA與相應(yīng)的靶mRNA近似完全配對，并且互補區(qū)域散布在靶mRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)而非僅僅局限在3 UTR，使得miRNA會結(jié)合到包括編碼區(qū)域在內(nèi)的多個位點上去，從而直接降解mRNA而非抑制其翻譯。例如mir-1723，它在擬南芥的花朵發(fā)育中介導(dǎo)翻譯抑制。與動物miR

35、NA不同的是，mir-172的互補位點與其靶基因APETALA2(AP2)的互補位點落在編碼區(qū)域而非3 UTR。因此，植物中的miRNA功能與siRNA 的功能非常相似。5.2 miRNA與細(xì)胞分化在鼠骨髓、胸腺的B淋巴細(xì)胞中miR-181特異表達(dá),參與增強哺乳動物B淋巴細(xì)胞分化， miR-181過表達(dá)引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞減少,T淋巴細(xì)胞增加,但目前miR-181作用的靶mRNA還未發(fā)現(xiàn)。此外,有人鑒定了干細(xì)胞和已分化細(xì)胞的miRNA,發(fā)現(xiàn)有些miRNA是干細(xì)胞特有的,例如,小鼠干細(xì)胞特異表達(dá)miR290295,人干細(xì)胞特異表達(dá)miR371373,推測是維持細(xì)胞全能性所必需的并參與細(xì)胞分化過程。一些

36、miRNA呈組織特異性表達(dá),似乎表明它們與維持分化細(xì)胞的功能有關(guān)7。近期有研究表明:miRNAs在心臟細(xì)胞的生長和分化過程中,也扮演著極為重要的平衡角色。miR-1家族包括miR-1-1和miR-1-2,在心肌、骨骼肌中特異表達(dá), miR-1能夠靶向Hand2基因的mRNA,而Hand2基因是心臟形成的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, miR-1能適時關(guān)閉Hand2蛋白制造,以促使心臟正常發(fā)育27。因為Hand2蛋白是一種重要的調(diào)節(jié)因子，所以發(fā)現(xiàn)這種miR-1對控制Hand2及其他蛋白具有重要意義。5.3 miRNA與細(xì)胞增殖和調(diào)亡果蠅中的bantam與細(xì)胞凋亡和生長控制有關(guān), 這是第一個被鑒定的與增殖相關(guān)

37、的miRNA基因。bantam的靶基因hid，hid已被證實是一種調(diào)亡誘導(dǎo)基因，bantam與hid mRNA的3 UTR互補結(jié)合，阻止hid mRNA的翻譯，抑制蛋白的表達(dá)，最終表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。相反，如果敲除bantam，hid的表達(dá)水平將上調(diào)，誘導(dǎo)調(diào)亡的發(fā)生，抑制細(xì)胞增殖。似乎，bantam扮演了一種癌基因的角色1。 Xu等在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了另一種調(diào)亡抑制miRNA：miR-14，它通過調(diào)節(jié)調(diào)亡效應(yīng)因子半胱天冬酶Drice而參與細(xì)胞調(diào)亡和脂肪代謝。目前還不清楚miR-14的靶基因，但發(fā)現(xiàn)miR-14的突變，會導(dǎo)致調(diào)亡效應(yīng)因子caspase Ice水平的增高，這可能是miR-14的作

38、用靶點1，7。2002 年,Calin 等首先發(fā)現(xiàn)，miR15a 和 miR-16-1在約65%的B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血?。˙CLLs）病人中表達(dá)下調(diào)。隨后不久，Cimmino等15又發(fā)現(xiàn)，在BCLLs 細(xì)胞中 miR15a和miR-16-1直接與BCL2的3UTR序列相互作用調(diào)控BCL2蛋白的表達(dá)，并與之成負(fù)相關(guān)，而BCL2是作為抗凋亡基因參與細(xì)胞凋亡過程的,這里miR15a和miR-16-1發(fā)揮了類似抑癌基因的作用，而且miR15a和miR-16-1還可能激活外源性APAF1胱天蛋白酶9(caspase-9)-PARP凋亡途徑，參與凋亡過程。5.4 miRNA與激素分泌美國洛克菲洛大學(xué)的研

39、究人員從糖誘導(dǎo)的鼠胰島及細(xì)胞系的RNA中克隆出大量長度為2123個核苷酸長度的RNA，其中，miR-375含量最多，研究發(fā)現(xiàn)，miR-375能夠抑制細(xì)胞系分泌胰島素，進(jìn)一步研究結(jié)果表明，miR-375通過與靶基因mtpn 的mRNA3 UTR不完全互補配對，轉(zhuǎn)錄后水平抑制了靶蛋白的表達(dá)，從而抑制了胰島素分泌的出胞過程1。這一研究發(fā)現(xiàn)為機體如何調(diào)節(jié)胰島素分泌過程開辟了新路，同時也為一些疾?。ㄈ缣悄虿。┑闹委煹於嘶A(chǔ)。組織特異性miRNAs，如miR-375，將可能成為一些疾病治療藥物新的作用靶點。5.5 miRNA與腫瘤發(fā)生及治療近幾年，miRNAs與人類腫瘤的關(guān)系逐漸引起了人們的廣泛注意，并

40、不斷有腫瘤發(fā)生與miRNAs的表達(dá)有關(guān)的例子的報道。研究表明,miRNA的表達(dá)水平在許多腫瘤中發(fā)生改變,它們可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。Calin 等5發(fā)現(xiàn) miR- 15a 和 miR- 16- 1 定位于染色體 13q14, 而這一區(qū)域在一半以上的 B- CLLs 病人中缺失。而且這一缺失在約 50%的外套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL), 16%40%的多發(fā)性骨髓瘤和 60%的前列腺癌中出現(xiàn)。推測他們可能起著腫瘤抑制基因的角色。隨后，Calin等又驚奇地發(fā)現(xiàn)，超過一半的miRNA位于和腫瘤發(fā)生相關(guān)的區(qū)域和脆性位點、雜合型丟失區(qū)(minimal reg

41、ions of loss of heterozygosity)、擴增區(qū)minimal regions of amplication (minimal amplicons)或斷裂點區(qū)(common breakpoint region)。； 此外，Iorio和Michael等發(fā)現(xiàn)，miR-143，miR-145 在結(jié)、直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌和淋巴瘤中的表達(dá)下調(diào)，這兩個基因位于 5q32-33。 He等研究發(fā)現(xiàn)，miR-221,-222,-146在乳頭狀甲狀腺癌中顯著上調(diào)。CiafreSA和Chan 等發(fā)現(xiàn)，miR-21 可作為一種抗凋亡因子，在惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌中的表達(dá)是上調(diào)的。Metz

42、ler等在兒童的Burkitt淋巴瘤中發(fā)現(xiàn) miR-155/BIC 的前體高表達(dá)。JohnsonSM 等發(fā)現(xiàn)肺癌let-7的表達(dá)常是降低的，let-7的靶點是Ras癌基因，RAS 信號通路在哺乳動物中調(diào)控細(xì)胞的正常生長和惡性增殖, RAS 蛋白過表達(dá)會引起細(xì)胞的惡性增殖，let-7表達(dá)的降低可致其靶點癌基因Ras表達(dá)的增加和促進(jìn)腫瘤生長5，9。可見, miRNA 表達(dá)水平的變化, 導(dǎo)致了腫瘤基因或抑癌基因轉(zhuǎn)錄后的異常調(diào)控, 從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。若miRNA的靶基因是癌基因,此miRNA的表達(dá)低于正常水平,也意味著它對癌基因的抑制作用減小,引起癌基因編碼的蛋白增加,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生;反之,若miRN

43、A的靶基因是抑癌基因,此miRNA的表達(dá)高于正常水平,也意味著它對抑癌基因的抑制作用增加,引起抑癌基因編碼的蛋白減少,也會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生11。從這種意義上理解,一些miRNA可能是潛在的癌基因或者抑癌基因,通過尋找具有癌基因和抑癌基因性質(zhì)的miRNA,可以為腫瘤的診斷和生物治療提供新的靶標(biāo)。許多miRNA的異常表達(dá)都與癌癥或其他一些疾病有關(guān), 最新有研究17發(fā)現(xiàn)，miRNA 成熟過程的總體抑制促進(jìn)了細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成，但目前對調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)的因子卻知之甚少。Lee J等19在miRNA基因上游鑒定了大量調(diào)節(jié)元件，這些元件可能在miRNA的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)上起重要作用。研究中他們提出了一

44、種可能，認(rèn)為一些與疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors ，TFs)導(dǎo)致了疾?。ㄈ缒[瘤）中miRNA的異常表達(dá)。經(jīng)進(jìn)一步研究分析并提出假設(shè)，包括c-Myb、 NF-Y、Sp-1、MTF-1和AP-2alpha在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)是miRNA表達(dá)的主調(diào)節(jié)子(master-regulators)。因此，對調(diào)節(jié)miRNA的轉(zhuǎn)錄因子的研究將為miRNA關(guān)聯(lián)疾病的治療提供有效幫助。關(guān)于miRNA功能的研究也正在進(jìn)行中，尋找下游靶基因是發(fā)現(xiàn)miRNA功能的一個直接手段。植物miRNA與靶基因幾乎完全配對結(jié)合，而且像小的干擾RNA一樣可以結(jié)合于mRNA的任何區(qū)域，

45、所以植物miRNA靶標(biāo)基因的鑒定相對直接而容易。研究表明，植物miRNA大部分作用于與發(fā)育過程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，尤其與模式建立和細(xì)胞分化有關(guān)。與植物相比，由于miRNA與靶基因的不完全配對，在動物基因組中直接尋找就顯得有些困難，但也有研究嘗試依據(jù)其他特征用生物信息學(xué)查找，但總的來說仍需要實驗檢驗。從僅有的例子來看，一個miRNA可調(diào)控細(xì)胞中與某一種物質(zhì)代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的幾種mRNA，這樣更能有效地發(fā)揮作用。尋找miRNA的靶基因是目前功能研究的熱點之一，因為這為揭示每一個miRNA的功能提供了必不可少的線索，從而為全面了解miRNA在細(xì)胞中的功能打下基礎(chǔ)。6 小結(jié)由于miRNA這類小分子在

46、生命活動中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能, 自被發(fā)現(xiàn)以來,miRNA即成為生命科學(xué)的研究熱點。無論在理論上和應(yīng)用上，miRNA為非編碼RNA參與基因調(diào)控提供了一個范例，miRNA是對中心法則中RNA作為中介角色的重要補充,促使生物學(xué)家重新思考細(xì)胞遺傳調(diào)控等方面的問題。miRNA作為新的研究切入點，為功能基因組學(xué)，基因治療，轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了一條有效途徑。近年來對miRNA的研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展,并且有大量的miRNA被鑒定,但是總體來說對miRNA的研究還處在理論水平上,關(guān)于miRNA的應(yīng)用的例子還較少。miRNA作為體內(nèi)正常表達(dá)的基因,與人類疾病（特別是腫瘤）和植物培育的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。盡管目

47、前miRNA應(yīng)用于基因治療的嘗試才剛剛開始,但已經(jīng)在藥物設(shè)計及疾病治療等實際應(yīng)用中顯現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力, 相信隨著對這種特殊分子研究的不斷深入,以miRNA為靶點或者以miRNA為治療手段的設(shè)想,以后可能會成為焦點，并且將為腫瘤和其它疾病的治療帶來新的希望。相信這些研究成果必將促進(jìn)整個生物界研究領(lǐng)域的進(jìn)步與發(fā)展。參考文獻(xiàn)：1 邊春景,劉鐵剛,劉霞,邵榮光. microRNA在動物體內(nèi)的功能J.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2005，2（5）：359362.2 何晨,譚軍,陳薇,microRNA的研究進(jìn)展J.生物技術(shù)通訊,2005,16: 674676.3 華友佳,肖華勝.microRNA的研究進(jìn)展J.生

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