1、疫苗基本知識,1,在發(fā)展中國家，死亡總?cè)藬?shù)的30%50%死于傳染病。 在發(fā)達國家，傳染病死亡人數(shù)僅占死亡總?cè)藬?shù)的4%8%，主要得益于疫苗的廣泛應(yīng)用。,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,一、概述,1、疫苗的概念,人工免疫：有計劃、有目的地給人體接種抗原，或輸入抗體或免疫細胞，使機體獲得某種特異性抵抗力，從而達到預(yù)防或治療某種疾病的目的。,一、概述,人工主動免疫 人工被動免疫 輸入物質(zhì) 抗原（疫苗） 抗體或致敏淋巴細胞 誘導(dǎo)時間 慢（14周） 快（立刻發(fā)揮作用） 維持時間 長（數(shù)月數(shù)年） 短（23周） 用 途 主要

2、用于預(yù)防 治療或應(yīng)急預(yù)防,人工主動免疫和人工被動免疫的比較,疫苗：用于人工主動免疫的生物制品。,一、概述,疫苗：刺激機體免疫系統(tǒng)對某種病原微生物處于高度戒備狀態(tài)-“時刻準備著！”,一、概述,人類急需的疫苗：HIV、HCV 生物武器和生物恐怖：炭疽桿菌、鼠疫桿菌、天花病毒,一、概述,2、理想疫苗的標(biāo)準, 安全：無致病性和接種后異常反應(yīng) 有效：可誘導(dǎo)產(chǎn)生可靠的保護性免疫 實用：易于接種、保存和運輸，價廉,3、疫苗的發(fā)展歷史,古典疫苗時期：牛痘苗、狂犬病疫苗 培養(yǎng)疫苗時期：脊髓灰質(zhì)炎疫苗、卡介苗 基因工程疫苗時期：乙型肝炎基因工程疫苗,一、概述,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活

3、載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,滅活疫苗（inactivated vaccine）：又稱死疫苗，是用化學(xué)或物理的方法，將具有感染性的完整的病原微生物殺死，使其失去傳染性而保留抗原性而成。,二、滅活疫苗,百日咳、乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、狂犬病、傷寒、鉤體病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰質(zhì)炎（salk）等疫苗。,二、滅活疫苗, 缺點：免疫力維持時間短，需要多次重復(fù)接種；主要誘發(fā)體液免疫，不能產(chǎn)生細胞免疫或黏膜免疫應(yīng)答；接種劑量較大，不良反應(yīng)；需要嚴格滅活。,二、滅活疫苗, 優(yōu)點：易于制備；免疫原性穩(wěn)定性高；儲存及運輸方便；易于制備多價疫苗；疫苗安全性高。,SAR

4、S疫苗研究 1、國內(nèi)全病毒滅活疫苗所用的SARS毒株均為原始毒力很強的毒株，其研發(fā)、檢定和將來的生產(chǎn)都必須需在P3級條件下進行，不能適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)。,二、滅活疫苗,2、尚無有效的動物模型，SARS流行爆發(fā)具有不確定性，各種疫苗的安全性和有效性的臨床前驗證較困難。,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,三、減毒活疫苗,減毒活疫苗（live-attenuated vaccine）：用人工誘變或從自然界篩選出的毒力高度降低或無毒的活的病原微生物制成的疫苗?？赡M自然發(fā)生隱性感染，誘發(fā)理想的免疫應(yīng)答而又不產(chǎn)生臨床癥狀。,結(jié)

5、核病、脊髓灰質(zhì)炎（Sabin）、麻疹、乙型腦炎、甲型肝炎、風(fēng)疹疫苗、腮腺炎等疫苗。,三、減毒活疫苗, 優(yōu)點：能誘發(fā)全面、穩(wěn)定、持久的體液、細胞和粘膜免疫應(yīng)答；一般只須接種一次；可采用口服、噴鼻或氣霧途徑免疫。 缺點：有效期短和熱穩(wěn)定性差，運輸、保存條件要求較高；回復(fù)突變危險；使用范圍相對窄。,三、減毒活疫苗,基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）：采用分子生物學(xué)技術(shù)，去除與毒力或毒力相關(guān)基因片段，使病原微生物毒力減低或喪失。用缺失突變毒株制成的疫苗。,三、減毒活疫苗,與自然突變株（多為點突變毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突變性狀明確、穩(wěn)定、不易發(fā)生毒力返祖的優(yōu)點。

6、,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,對于某些抗原性弱、易發(fā)生免疫逃避的病原體，常規(guī)疫苗往往難以獲得有效的免疫應(yīng)答及保護性。,四、亞單位疫苗,一些免疫保護機制不清，可能誘導(dǎo)免疫病理反應(yīng)，有潛在致腫瘤作用的病毒，以及不易培養(yǎng)的病原體，則難以用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)疫苗。,亞單位疫苗（subunit vaccine）：不含病原體核酸，選用能誘發(fā)宿主產(chǎn)生中和抗體的微生物蛋白或表面抗原而制成的疫苗。,四、亞單位疫苗, 白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素 流感嗜血桿菌莢膜多糖、腦膜炎球菌莢膜多糖 流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶 乙型肝炎HBsAg

7、（基因工程疫苗） 人乳頭瘤病毒,四、亞單位疫苗,優(yōu)點：除去了病原體中與誘發(fā)保護性免疫無關(guān)或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明顯增強而穩(wěn)定，可靠性提高，對機體引起的不良反應(yīng)小。 缺點：需要選用佐劑；不能誘發(fā)細胞免疫和黏膜免疫。,四、亞單位疫苗,將病原體中能誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的目的抗原編碼基因克隆后，插入適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧吮磉_載體質(zhì)粒； 再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞中高效表達目的基因； 分離、提取、純化目的蛋白而制成。,基因重組亞單位疫苗 (genetic engineering subunit vaccine),四、亞單位疫苗,下一步工作計劃,基因工程疫苗發(fā)展的重點 不

8、能或難以培養(yǎng)的病原體； 有潛在致癌性或免疫病理作用的病原體； 傳統(tǒng)疫苗效果差或不良反應(yīng)大的病原體； 能簡化免疫程序、降低成本的多價疫苗。,四、亞單位疫苗,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,活載體疫苗（live vector vaccine）：又稱重組載體疫苗（recombinant vector vaccine），是將有效的目的抗原的編碼基因?qū)牖钶d體（無或弱毒的細菌或病毒株）中，構(gòu)建重組菌株；目的基因可隨重組菌株在宿主體內(nèi)的增殖而大量表達，從而誘發(fā)相應(yīng)的免疫保護作用。,五、活載體疫苗,載體：腺病毒、牛痘病毒、

9、金絲雀痘病毒、傷寒沙門菌減毒株、卡介苗、乳桿菌等。 病原體：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾桿菌等。,五、活載體疫苗,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,1990年，Wolff等首次發(fā)現(xiàn)，給小鼠肌肉注射裸露質(zhì)粒DNA后，質(zhì)粒攜帶的基因可被肌細胞攝取并在其中表達，還可誘生特異性免疫應(yīng)答。,四、核酸疫苗,核酸疫苗（nucleotide vaccine）：又稱DNA疫苗（DNA vaccine），是將一種或多種目的抗原的編碼基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上；再將重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)，在宿主細胞內(nèi)表達目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫

10、應(yīng)答。,四、核酸疫苗,目前進入臨床試驗的核酸疫苗有HIV DNA疫苗和瘧疾 DNA疫苗。,四、核酸疫苗,由于核酸疫苗具有構(gòu)建容易、生產(chǎn)方便、表達穩(wěn)定及可誘發(fā)全面的免疫應(yīng)答等特點，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，被譽為疫苗的“第三次革命”。,四、核酸疫苗,局部注射的核酸（重組質(zhì)粒DNA）被周圍的細胞（如黏膜上皮細胞、抗原提呈細胞）攝取后，進入核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄，并在胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白。,1、免疫機制,四、核酸疫苗,目的蛋白被蛋白酶復(fù)合體降解成含有表位的抗原肽，可作為： “內(nèi)源性抗原”：與MHC類分子結(jié)合，誘發(fā)CTL介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答。 “外源性抗原”：與MHC類分子結(jié)合，誘

11、發(fā)偏向Th1型免疫應(yīng)答。,四、核酸疫苗,目的蛋白亦可通過細胞分泌或細胞破裂的方式進入組織間，以天然折疊形式激活B淋巴細胞而產(chǎn)生抗體。,四、核酸疫苗,DNA疫苗接種后，體內(nèi)僅表達pgng水平的外源蛋白，但能誘發(fā)強而持久的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。 如何解釋這一現(xiàn)象呢？,四、核酸疫苗,目的基因（含載體質(zhì)粒）含有CpG基序的回文序列，能激活較強的CTL效應(yīng)，并能激活巨噬細胞與NK細胞，因此，CpG回文序列被稱為免疫刺激DNA序列。,CpG基序與IL-2、TNF-、IFN-的基因結(jié)構(gòu)相似而產(chǎn)生協(xié)同作用。,四、核酸疫苗,2、構(gòu)建與免疫,目的基因的選擇：側(cè)重于免疫原性，即所表達的目的蛋白刺激機體免疫應(yīng)答的能

12、力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T細胞抗原表位，是保證核酸免疫有效的先決條件。,四、核酸疫苗,核酸疫苗所選擇的目的基因應(yīng)盡量避免有害基因成分，特別是病毒或腫瘤的核酸免疫。,四、核酸疫苗,載體的選擇：構(gòu)建DNA疫苗的質(zhì)粒通常是非復(fù)制型的真核表達質(zhì)粒，能高水平地表達目的基因。,四、核酸疫苗,重組質(zhì)粒可分為兩個部分： 轉(zhuǎn)錄部分：由啟動子、插入的目的抗原cDNA和poly A終止子組成，指導(dǎo)目的蛋白在體內(nèi)表達，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。 佐劑部分：CpG基序。,四、核酸疫苗,啟動子的選擇：質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)表達外源性蛋白的水平與調(diào)控DNA表達的啟動子關(guān)系密切。表達水平的不同又直接影響免疫應(yīng)答的強度和持

13、續(xù)性。,四、核酸疫苗,DNA疫苗的優(yōu)化 聯(lián)合構(gòu)建：在載體質(zhì)粒中插入2個或2個以上目的抗原基因，既能激活CD8T細胞產(chǎn)生特異性CTL，又能激活CD4Th2細胞產(chǎn)生體液免疫。 協(xié)同構(gòu)建：將目的基因與某種細胞因子的基因構(gòu)建成嵌合基因，以促進目的基因的免疫效果。,四、核酸疫苗,免疫途徑、劑量、時間：常見免疫途徑有肌肉注射、皮內(nèi)或皮下免疫、粘膜免疫等。,四、核酸疫苗,3、核酸疫苗與傳統(tǒng)疫苗的比較,傳統(tǒng)免疫所使用的抗原一般是滅活病原體、減毒的活病原體或病原體的亞單位蛋白。 核酸疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段，可提供與天然構(gòu)象極為接近的目的蛋白，提呈給宿主免疫系統(tǒng)，與自然感染過程相似。,四、核酸疫苗,核

14、酸疫苗兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答的高效力。,四、核酸疫苗,滅活疫苗和亞單位疫苗在體內(nèi)代謝較快，難以長時間維持較穩(wěn)定的含量，需多次接種免疫原，加強免疫。,核酸疫苗可在體內(nèi)不斷翻譯表達，較長時間維持較高的蛋白水平，免疫具有連續(xù)性，一次接種可獲得長期或終身免疫力。,四、核酸疫苗,采用不同毒株之間的保守DNA序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，從而有效地預(yù)防病原體極易發(fā)生變異的某些疾?。ㄈ绫透窝住⒓仔土鞲?、艾滋病等）。,四、核酸疫苗,核酸疫苗與世界衛(wèi)生組織兒童計劃免疫長遠目標(biāo)（用一種疫苗預(yù)防多種疾?。┫辔呛希粌H能預(yù)防疾病，還可作為治療性疫苗，治療一些復(fù)雜難

15、治的疾病，如病毒性肝炎、癌癥等。,四、核酸疫苗,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,植物疫苗（plant-based vaccine）：亦稱轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenic plant vaccine），是指將抗原基因?qū)胫参锛毎⒃谄渲斜磉_，人食用已表達目的抗原的轉(zhuǎn)基因植物后，可誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答的新型疫苗。,五、植物疫苗,（1）建立整合抗原基因的穩(wěn)定表達植株，并可通過無性或有性繁殖生產(chǎn)大量的轉(zhuǎn)基因植物。,1、植物疫苗的構(gòu)建,五、植物疫苗,（2）建立瞬時表達植株，即利用基因工程植物病毒為載體，將抗原編碼基因

16、插入到植物病毒基因中，再將重組病毒株感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制而得以高效表達，獲得高產(chǎn)量的目的蛋白。,五、植物疫苗,（1）植物種子、塊莖、果實等是蛋白質(zhì)很好的聚積和保存場所，使植物疫苗（重組蛋白）的生產(chǎn)、運輸和儲存更為容易，免疫途徑更簡便、安全。,2、植物疫苗的優(yōu)點,五、植物疫苗,（2）植物疫苗（抗原）通過胃內(nèi)酸性環(huán)境時，可受到細胞壁的保護，直接到達腸粘膜部位，誘發(fā)粘膜和全身免疫應(yīng)答，比傳統(tǒng)的免疫途徑更有效。,五、植物疫苗,（3）植物疫苗不需嚴格的分離純化程序，經(jīng)濟價廉，可望替代傳統(tǒng)的發(fā)酵生產(chǎn)，有利于在發(fā)展中國家推廣。,五、植物疫苗,一、概述二、滅活疫苗三、減毒活疫苗四、亞單位疫苗五、活載體疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治療性疫苗,微生物疫苗,預(yù)防性疫苗的接種對象是健康人群，多采用模擬自然感染過程的策略，一般為微生物的保護性抗原，成分較單純，主要用于免疫預(yù)防作用，對機體無明顯的病理損傷，使用安全可靠。,六、治療性疫苗,預(yù)防性疫苗已廣泛用于預(yù)防病原體進化相對保守、自然感染可獲得牢固免疫力、保護性免疫主要依賴于中和抗體的傳染病，如天花、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹乙型肝炎、白喉、破傷風(fēng)等。,六、治療性疫苗,治療性疫苗（therapeutic vaccine）的接種對象是持續(xù)性感染患者，其抗原成分不像預(yù)防性疫苗那樣單純，可根據(jù)需要進行組合和調(diào)整，例如，將微生物抗原（基因）與不同