1、第三章 蛋白質(zhì)工程 Protein Engineering,主講教師 林娜 碩士,主要講授內(nèi)容： 1 概述 2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 3 蛋白質(zhì)工程的研究方法 4 蛋白質(zhì)工程技術(shù)的應(yīng)用 5 蛋白質(zhì)組學(xué),本章要求： 了解蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu) 理解蛋白質(zhì)的研究方法 了解蛋白質(zhì)的運用 了解蛋白質(zhì)組學(xué),在自然界中，構(gòu)成生命最基礎(chǔ)的物質(zhì)有： 蛋白質(zhì) 最重要 核酸 最根本 多糖 脂類,各種生命功能、生命現(xiàn)象、生命活動都和蛋白質(zhì)有關(guān),1 概述1.1 蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)很重要具體表現(xiàn)在：,1）蛋白質(zhì)執(zhí)行著酶的功能 2）通過激素調(diào)節(jié)代謝作用 3）產(chǎn)生相應(yīng)的抗體 4）構(gòu)建各種生物膜,1.2 蛋白質(zhì)工程,蛋白質(zhì)工程就是在蛋白質(zhì)

2、的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。 蛋白質(zhì)工程自誕生之日起，就與基因工程密不可分。,2.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primary structure) 2.1.1 定義 指氨基酸按一定的順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈，也是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。 2.1.2 Anfinsen原理 每一種蛋白質(zhì)分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級結(jié)構(gòu)，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結(jié)構(gòu)，也就是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的二級三級等高級結(jié)構(gòu),2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),2.1.3 等電點,蛋白質(zhì)顆粒的電

3、荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)游離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子（凈電荷為O)，此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點pI)。,2.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),2.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（secondary structure）,2.2.1 定義 二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象） 2.2.2 主要形式 -螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角等,四種不同的螺旋,在平行（A）和反平行（B）折疊片中氫鍵的排列,反向折疊,RNase的一些二級結(jié)構(gòu),2.3 三級結(jié)構(gòu)（tertiary

4、 structure）,三級結(jié)構(gòu)主要針對球狀蛋白質(zhì) 是指整條多肽鏈由二級結(jié)構(gòu)元件構(gòu)建成的總?cè)S結(jié)構(gòu),胰島素的三級結(jié)構(gòu),2.4 四級結(jié)構(gòu)（quaternary structure）,四級結(jié)構(gòu)是指在亞基和亞基之間通過疏水作用等次級鍵結(jié)合成為有序排列的特定的空間結(jié)構(gòu)。 四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每個球狀蛋白質(zhì)稱為亞基,血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu),2.5 蛋白質(zhì)分子間的相互作用,亞基間的聚合可以被解離，可以重新聚合 四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子亞基間可以雜交 多肽與蛋白質(zhì)分子間可以聚合,2.6 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功

5、能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，HPDB數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，如 Homology 等軟件分析,常用蛋白序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 PIR蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 OWL非冗余蛋白質(zhì)序列 EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫 TrEMBLEMBL的翻譯數(shù)據(jù)庫 GenBANK核酸序列數(shù)據(jù)庫 PROSITE蛋白質(zhì)功能位點 SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu) SWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示 DSSP蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)參數(shù) FSSP已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族 SCOP蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫 CATH蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫 Pfam蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域,2.7蛋白質(zhì)

6、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,2.7.1 結(jié)構(gòu)決定功能 必須基團、非必須基團 2.7.2 如何利用結(jié)構(gòu)執(zhí)行特定的功能的呢？ 正逐步被揭示,3 蛋白質(zhì)工程的研究方法3.1蛋白質(zhì)工程的研究策略,反向生物學(xué)技術(shù) 根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能； 反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。,序列功能預(yù)測流程圖,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測流程圖,3.2 蛋白質(zhì)全新設(shè)計,3.2.1 設(shè)計目標的選擇 3.2.2 蛋白質(zhì)設(shè)計技術(shù)與方法 序列最簡化法 3.2.3 改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 3.2.3.1 基本步驟 3.2.3.2 人工定點突變 M1

7、3載體法 PCR法,4 蛋白質(zhì)工程技術(shù)的應(yīng)用,4.1 胰蛋白酶 4.2 金屬硫蛋白 4.3 人白細胞介素-2 4.4 組織纖溶酶原激活因子 4.5 枯草桿菌蛋白酶,金屬硫蛋白（Metallothionein) ，簡稱MT,含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子 MT分子呈橢圓形，分子量為6500道爾頓，兩個結(jié)構(gòu)域拼接在一起，每個分子含7-12個金屬原子，具有特殊的光吸收，構(gòu)象較堅固，具有較強的耐熱性。,4.2 金屬硫蛋白,金屬硫蛋白的六大功能,1)清除體內(nèi)自由基、防止機體衰老：MT是體內(nèi)清除自由基能力最強的一種，其清除羥自由基的能力約為SOD的10,000倍2)解除重金屬的毒性：MT的巰基基團（

8、-SH）能強烈螯合有毒金屬汞、銀、鉛、鎘、砷、鉻、鎳等 3)參與體內(nèi)微量元素的代謝：在體內(nèi)，MT可根據(jù)體內(nèi)微量元素的狀況對鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘的吸收、儲存、運輸和釋放等進行精細調(diào)節(jié)，使機體達到最佳生理狀態(tài)。,4.2 金屬硫蛋白,4)增強機體對各種不良狀態(tài)的適應(yīng)能力：當機體處于各種不良狀態(tài)時，體內(nèi)MT含量增加，從而提高鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘等微量元素的濃度，機體適應(yīng)能力隨之增強。5)鋅元素的貯存庫：每100毫克鋅金屬硫蛋白含6.9毫克鋅，肝、腎中的鋅元素主要是以金屬硫蛋白的形式貯存。6)防止細胞癌變：MT可消除自由基、重金屬（砷、汞、鎘、鉻、鎳）、烷化劑、電離輻射以及紫外線對D

9、NA、RNA、酶、蛋白質(zhì)以及細胞膜的損傷，從而可以防止它們的致癌、致突變作用,4.2 金屬硫蛋白,從1978年到1999年共舉行了四次國際專題研討會，我國將MT列入863重大攻關(guān)計劃，1995年列入國家級火炬計劃。 結(jié)果表明：MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、美容護膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。,結(jié)構(gòu)域的拼接,5 蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics） 2001年的Science雜志已把蛋白質(zhì)組學(xué)列 為六大研究熱點之一，其“熱度”僅次于干細胞研究,5.1 人類蛋白質(zhì)組計劃概述,2001年，國際人類蛋白質(zhì)組組織宣

10、告成立。 一項是由中國科學(xué)家牽頭執(zhí)行的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”； 另一項是以美國科學(xué)家牽頭執(zhí)行的“人類血漿蛋白質(zhì)組計劃”，由此拉開了人類蛋白質(zhì)組計劃的帷幕。,5.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的研究意義和背景,隨著人類基因組計劃的實施和推進，生命科學(xué)研究已進入了后基因組時代。在這個時代，生命科學(xué)的主要研究對象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。 1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心：AustraliaProteomeAnalysisFacility(APAF),5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容包括：,5.3.1 蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)

11、，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進行鑒定研究。 5.3.2 翻譯后修飾：很多mRNA表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷 酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式。 5.3.3 蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析，基因表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能分析。另外對蛋白質(zhì)表達出來后在細胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。熒光蛋白表達系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)定位的一個很好的工具。 5.3.4 分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋

12、白質(zhì)相互作用。,5.4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),5.4.1蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備 5.4.2蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離和分析 雙向凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)、二維色譜(2D-LC)、二維毛細管電泳(2D-CE)、液相色譜毛細管電泳(LC-CE),5.5 蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展趨勢,在基礎(chǔ)研究方面，蛋白質(zhì)組研究技術(shù)被應(yīng)用到各種生命科學(xué)領(lǐng)域 在應(yīng)用研究方面，蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一 在技術(shù)發(fā)展方面，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法將出現(xiàn)多種技術(shù)并存，各有優(yōu)勢和局限的特點,5.6 蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床研究中的應(yīng)用,臨床蛋白質(zhì)組學(xué)是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究，它主要圍繞疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等方面開