1、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (elisa),elisa技術(shù)簡介,elisa的基本原理,elisa的類型和方法,elisa方法注意事項和應(yīng)用,酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）,酶聯(lián)免疫吸附試驗( enzyme-linked immunosorbent test, elisa ) ： 基于抗原-抗體反應(yīng)的特異性和等比例性，是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附（包被）在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入相應(yīng)的酶底物后發(fā)生顏色反應(yīng)，通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，通過顏色反應(yīng)

2、的深淺檢測標本中相應(yīng)抗體或抗原含量的檢測技術(shù) 。,elisa的發(fā)展概況,自從engvall和perlman（瑞典，1971）首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）以來，由于elisa技術(shù)具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用 。 隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，將利用基因工程技術(shù)制備的抗原或單克隆抗體包被酶標板后，極大地提高了elisa檢測技術(shù)的特異性，加之電腦化程度極高的elisa檢測儀的使用，使elisa更為簡便實用和標準化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測方法之一。 目前，elisa檢測技術(shù)在科學(xué)研究、疾病診斷、檢驗檢疫、環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。,elisa的基

3、本原理,酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過分光光度計進行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使elisa方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。,基本原理,elisa試劑盒的組成,完整的elisa試劑盒通常包含以下各組分：（1）已包被抗原或

4、抗體的固相載體（俗稱酶標板）；（2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；（3）酶的底物；（4）參考標準品（定量試劑盒）及其稀釋液；（5）酶標記物及樣本的稀釋液；（6）洗滌液（通常為濃縮液，用前按比例稀釋）；（7）反應(yīng)終止液； （8）封口膜若干、說明書一份。,酶標板,elisa常用酶類,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, hrp),dh2+ h2o2 d + h2o上式中，dh2為供氫體，h2o2為受氫體。,常用底物： 1. 鄰苯二胺(opd)，產(chǎn)物為橙紅色（492nm檢測）； 2. 四甲基聯(lián)苯胺(tmb)，產(chǎn)物為藍色，酸性條件下變?yōu)?黃色（450nm檢測）。,反應(yīng)終止液

5、：hcl或h2so4溶液。,堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, ap),常用底物： 1. 對硝基苯磷酸酯 ( p-npp )，產(chǎn)物為黃色的對硝基酚 （405nm檢測）； 2. 發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于熒光測定，靈敏度高于顯色底物的方法。,反應(yīng)終止液：naoh 溶液。,elisa所需儀器設(shè)備,恒溫箱,洗板機,酶標儀,elisa的類型和方法,半定量elisa試驗,定量elisa試驗,試驗?zāi)康?試驗性質(zhì),間接法,雙抗夾心法 (直接夾心法),bas-elisa,雙夾心法 (間接夾心法),競爭法elisa,直接法,直接法elisa是將酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的

6、抗體或抗原結(jié)合形成酶標抗原-抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計算出包被在酶標上的抗體或抗原的量（見后圖） 。該方法可用于檢測抗體或抗原。,直接法elisa,優(yōu)點: 1. 特異性高、準確性好； 2. 實驗操作簡便，用時短。,缺點: 1. 應(yīng)用范圍較小，生產(chǎn)難度大。 需制備各種酶標抗原或抗體。,間接法elisa,間接法elisa是將酶標記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后，再以酶標二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過測定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進而計算出抗原或抗體的量（見后圖）。 該方法可用于抗體檢測，是目前檢測抗體最常用的elis

7、a方法。,優(yōu)點: 1. 適用范圍廣，無需制備特殊的酶標抗體; 2. 制備方便，價格便宜。,雙抗夾心法elisa,雙抗夾心法是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，在用酶標的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計算出捕獲的抗原量，本方法也稱為直接夾心法（見后圖） 。 該方法可用于抗原檢測，例如細胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細菌、病毒等，是目前檢測抗原最常用的elisa方法。,優(yōu)點: 1. 適用范圍廣，無需制備特殊的酶標抗體。 2. 制備方便，價格便宜。,雙夾心法elisa,雙夾心法是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，然后用未標記的抗體與抗

8、原反應(yīng)形成抗體-抗原-未標記抗體復(fù)合物；再應(yīng)用酶標二抗和抗體-抗原-未標記抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-未標記抗體-酶標二抗復(fù)合物，也稱為間接夾心法（見后圖）。 該方法可用于抗原檢測，例如蛋白質(zhì)、病原體等。,優(yōu)點: 1. 靈敏度高。 2. 制備方便，無需制備特殊的酶標抗體。,缺點: 實驗操作較復(fù)雜。,bas-elisa,bas-elisa即生物素-親和素系統(tǒng)（biotin avidin system, bas）elisa法：是先將抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，然后用生物素（biotin）標記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-生物素標記抗體復(fù)合物，再依次加入親和素、酶標記生物素（或直接加入酶

9、標記的親和素），最后加底物顯色。 生物素是一種生長因子，廣泛分布于動、植物體內(nèi)，又稱輔酶r或維生素h。親和素由四個亞單位組成，對生物素具有高度親和力，即一個親和素可以結(jié)合4個生物素分子。因此，本方法具有信號放大功能（特點）。 該方法可用于抗原、抗體以及dna和rna（生物素）檢測。,bas-elisa實驗原理,競爭法elisa,競爭法elisa的實驗原理：將包被了抗體的酶標板的微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度的系列標準品溶液和酶標記物（酶標抗原）；在測定孔中同時加入酶標抗原和待檢樣本（抗原），酶標抗原和樣品互相競爭包被抗體的結(jié)合點，形成酶標記的抗原-抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒有吸

10、附的酶標抗原通過洗滌去除，加入底物后，復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。當(dāng)測定孔內(nèi)的樣本不含抗原時，固相上的抗體將和酶標抗原結(jié)合，加入底物后顯色較深；當(dāng)樣本含有抗原時，樣本中的抗原和酶標抗原共同競爭抗體的結(jié)合位點。酶標抗原結(jié)合的比例越高，說明結(jié)合在固相抗體上的待測抗原就越少，反之亦然；在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量，從而進一步得知樣本中抗原的多少。,測定孔,酶標記物,底物溶液,對照孔,酶標記物,底物溶液,參考液(不含抗原),樣本(含抗原),競爭法elisa實驗原理,半定量elisa試驗,間接法檢測血清hbsab含

11、量,設(shè)計加板次序 (空孔、陰、陽),加板 (陰、陽、樣),37, 30min,加酶標抗體 (空孔除外),洗滌3次，拍干,加底物溶液 (空孔除外),37, 10-30min,加終止液 (空孔除外),避光,上機檢測、結(jié)果判定 (空孔調(diào)零),37, 30min,洗滌3次，拍干,雙抗夾心法檢測血清il-2含量,設(shè)計加板次序 (空孔、陰、陽、標準),加板 (陰、陽、標準、樣),37, 30min,加酶標抗體 (空孔除外),洗滌3次, 拍干,加底物溶液 (空孔除外),37, 10-30min,加終止液 (空孔除外),避光,上機檢測、繪制標準曲線 (空孔調(diào)零),從標準曲線上 讀取樣品含量,37, 30min,洗滌3次, 拍干,elisa試驗中的注意事項,必須設(shè)立陽性、陰性和空孔對照孔，控制試驗條件并檢驗試劑盒的質(zhì)量；,待測樣品應(yīng)設(shè)立雙復(fù)孔或三復(fù)孔；,半定量（或定性）elisa中結(jié)果判斷依據(jù)通常為： od樣/od陰2.1時為陽性結(jié)果，2.1時為陰性；,酶標板洗滌時確保洗滌干凈，避免假陽性；,定量elisa中每一批次的試劑盒必須繪制一個標準曲線；,定量elisa中還應(yīng)特別注意試劑盒的靈敏度(測定范圍)。,elisa試驗的應(yīng)用,抗體及抗體亞類檢測（包括血清、制備的