1、,植物體細(xì)胞遺傳學(xué)研究(somatic cell genetics),周口師范學(xué)院生命科學(xué)系,體細(xì)胞遺傳學(xué)研究的內(nèi)容,體細(xì)胞遺傳學(xué)是遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)和組織培養(yǎng)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。 一般的細(xì)胞遺傳學(xué)研究的內(nèi)容是染色體在減數(shù)分裂過程中的行為及其遺傳后果。 體細(xì)胞遺傳學(xué)主要研究離體培養(yǎng)的體細(xì)胞在有絲分裂過程中的遺傳規(guī)律。,研究的范疇,真核生物體細(xì)胞的特點： 在二倍體生物中，沒分化的體細(xì)胞都有2n染色體數(shù)； 在上代和下代體細(xì)胞間，染色體都是通過有絲分裂而傳遞的。 體細(xì)胞：指植物體內(nèi)除了孢子、配子和孢子母細(xì)胞之外的所有細(xì)胞。,研究的范疇,花藥培養(yǎng)屬于體細(xì)胞遺傳學(xué)研究的范疇嗎？ 在花藥的培養(yǎng)中，花粉粒的發(fā)育偏離

2、原來的方向，其結(jié)果不是形成雄配子體，而是經(jīng)過連續(xù)的有絲分裂，形成單倍體愈傷組織或花粉胚。 更重要的是，由花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體更是體細(xì)胞遺傳學(xué)研究的理想材料。,體細(xì)胞遺傳學(xué)分類,種間體細(xì)胞遺傳學(xué)：研究不同物種體細(xì)胞融合后異核體的遺傳行為，對人工合成體細(xì)胞雜種有重要的指導(dǎo)意義。 種內(nèi)體細(xì)胞遺傳學(xué)：對來自同一物種的體細(xì)胞進(jìn)行研究，通過對細(xì)胞進(jìn)行誘變、選擇和互補(bǔ)分析等，不但可以獲得新的基因型，而且有助于對某些一般性問題的了解，如基因的結(jié)構(gòu)和功能，基因的表達(dá)和調(diào)控，細(xì)胞分化與發(fā)育的機(jī)制等。,自然條件下的細(xì)胞周期,正常的細(xì)胞周期：在頂端分生組織中，由于DNA合成之后立即進(jìn)行核與細(xì)胞質(zhì)的分裂，故細(xì)胞都保持在

3、二倍體水平。 異常的細(xì)胞周期：以上細(xì)胞的衍生細(xì)胞，在以后的分化過程中，進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂和核內(nèi)復(fù)制，結(jié)果是出現(xiàn)體細(xì)胞多倍性。,中柱鞘、原形成層和形成層細(xì)胞保持二倍體狀態(tài)，因此，通過莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的植株和中柱鞘起源的側(cè)根始終是二倍體的。,物種分類,非體細(xì)胞多倍體物種(non-polysomatic species): 裸子植物 10%的被子植物 向日葵、胡蘿卜、麝香百合等 體細(xì)胞多倍體物種(polysomatic species): 90%的被子植物 豌豆、煙草、芍藥等,離體培養(yǎng)中的遺傳與變異,1 離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性 離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂。有絲分裂的DNA半保留復(fù)制和染色體均等分裂機(jī)制

4、，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。 在準(zhǔn)確選擇培養(yǎng)方式的前提下，離體無性繁殖可以具有較高的遺傳穩(wěn)定性（Phillip等，1994）。正是基于這一理論，利用離體培養(yǎng)技術(shù)建立了多種植物的無性繁殖體系。,2 離體培養(yǎng)條件下遺傳變異的特點,2.1 普遍性 植物種類、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)類型 不同的植物材料在不同的培養(yǎng)類型中都會發(fā)生變異。,表1 部分植物離體培養(yǎng)再生植株的表型變異頻率,2.2 局限性 從表型上看，在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生的體細(xì)胞變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長勢、育性、某些抗性等性狀的變異。 從生理生化特性上看，容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長等變異。 一些單

5、基因控制的性狀不僅發(fā)生隱形突變，也發(fā)生顯性突變。,2.3 嵌合性： 嵌合性是指同一有機(jī)體中同時存在有遺傳組成不同的細(xì)胞，它是組織培養(yǎng)中常見的現(xiàn)象。 在自然界中，染色體數(shù)的嵌合性是由雜種或新近合成的多倍體的遺傳不穩(wěn)定性造成的。 這種混倍體現(xiàn)象的出現(xiàn)表明，再生植株可能是由愈傷組織中一個以上細(xì)胞起源的。,影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素,1 供體植物 供體植物倍性水平 植物的基因型 外植體細(xì)胞分化程度,影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素,2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式 Torrey(1961)，通過改變培養(yǎng)基成分，可有選擇地誘導(dǎo)和保持倍性較高的細(xì)胞分裂。 豌豆根段 基本培養(yǎng)基+ 2，4-D 二倍體細(xì)胞發(fā)生分裂 基本培養(yǎng)基+

6、 2，4-D+激動素+酵母浸出液 有選擇地誘導(dǎo)四倍體細(xì)胞發(fā)生分裂。,培養(yǎng)基的物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會引起細(xì)胞的變異。 在懸浮培養(yǎng)的條件下，選擇壓有利于二倍體細(xì)胞，而在半固體培養(yǎng)的條件下，四倍體細(xì)胞出現(xiàn)的頻率較高。 一般來講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。,影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素,3 繼代培養(yǎng)的次數(shù) 一般來講，繼代時間越長，繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異的幾率就越高。,體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ),1 DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制 DNA在核內(nèi)重復(fù)復(fù)制（endoreduplication）但不發(fā)生細(xì)胞分裂，其結(jié)果是染色體組數(shù)增加，形成同源多倍體。 如果這種DNA重復(fù)復(fù)制多次發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)DNA含量就

7、會不斷上升。,體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ),2 染色體斷裂與重組 染色體斷裂與重組是離體培養(yǎng)中染色體結(jié)構(gòu)變異的主要原因之一，也是體細(xì)胞變異中經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象。 染色體結(jié)構(gòu)變異的細(xì)胞學(xué)特征是：分裂中期出現(xiàn)斷裂的染色體片段以及染色體橋，其結(jié)果是在體細(xì)胞中出現(xiàn)染色體易位、缺失、倒位等多種類型的結(jié)構(gòu)變異。,體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ),3 非正常有絲分裂 離體培養(yǎng)中，染色體除了整倍性變異外，還可觀察到大量的非整倍性變異，這種愈傷組織往往分化能力低下，再生植株大多生長不正常，有性繁殖的遺傳穩(wěn)定性差。 紡錘體形成異常使得有絲分裂不正常是其原因之一。 非正常有絲分裂包括多極紡錘體形成和核裂。,體細(xì)胞變異的分子遺傳

8、學(xué)基礎(chǔ),1 堿基突變 堿基突變是指DNA序列中堿基的改變。 如果改變堿基的DNA序列處于結(jié)構(gòu)基因的位置或調(diào)控序列的位置，就可能導(dǎo)致遺傳狀態(tài)的改變。堿基突變是產(chǎn)生體細(xì)胞變異的重要途徑之一。 對于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳，而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，這一點已在水稻、煙草和玉米的體細(xì)胞變異中得以證實（張春義和楊漢民，1994）。,體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),2 DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失 在許多植物中均觀察到，DNA分子中一些重復(fù)序列在培養(yǎng)條件下發(fā)生了擴(kuò)增。 在許多植物種類中還觀察到，在組織培養(yǎng)過程中，以及經(jīng)組織培養(yǎng)再生的植株，甚至在這些植株的后代中，有時也會發(fā)生DNA序列

9、丟失的現(xiàn)象。,體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),研究還發(fā)現(xiàn)，DNA的減少不僅發(fā)生在核DNA中，也有發(fā)生在葉綠體基因組中。 一些DNA序列的減少只發(fā)生在愈傷組織形成階段，植株再生過程中又恢復(fù)到正常狀態(tài)，目前還不清楚這種變化的生物學(xué)意義。,體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),3 轉(zhuǎn)座子活化 轉(zhuǎn)座子(transposon)：在基因組中可以移動的一段DNA序列。 轉(zhuǎn)座子首先是由McClintock在玉米中發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)已證實它是引起許多遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象的重要原因。,體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),我國學(xué)者朱至清（1991）認(rèn)為，可能是轉(zhuǎn)座子在培養(yǎng)環(huán)境中首先被激活而轉(zhuǎn)座，從而造成染色體的結(jié)構(gòu)變異。 目前關(guān)于轉(zhuǎn)座子引起體細(xì)胞變異

10、的直接實驗證據(jù)還十分有限，但許多學(xué)者認(rèn)為，用轉(zhuǎn)座子解釋體細(xì)胞變異有許多合理性，如變異頻率高、沉默基因活化等。,體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),4 DNA甲基化 DNA甲基化（methylation）在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。離體培養(yǎng)再生植株的甲基化變化首先在玉米體細(xì)胞無性系再生植株中發(fā)現(xiàn)。 胡蘿卜、番茄、馬鈴薯等多種植物的培養(yǎng)細(xì)胞或再生植株中，均報道發(fā)現(xiàn)了因DNA甲基化改變而產(chǎn)生的體細(xì)胞變異（刁現(xiàn)民和孫敬三，1994）。,體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),除了DNA甲基化程度的增加外，離體培養(yǎng)中的某些變異還來自于DNA甲基化程度的降低。 最典型的例子是油棕體細(xì)胞胚植株由于甲基化的減少而造成的雄蕊雌性

11、化變異。（Rival，1997）。,體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)與選擇,1 體細(xì)胞變異誘導(dǎo)材料的選擇 1.1 目標(biāo)性狀的可行性 體細(xì)胞突變的頻率雖然較高，但對于某一個體來講，變異的性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀，是體細(xì)胞突變系選擇的目的。,體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)與選擇,1 體細(xì)胞變異誘導(dǎo)材料的選擇 1.2 試驗材料的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 必需充分考慮試驗植物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平，只有對起始材料有良好的培養(yǎng)技術(shù)，才有可能制定完滿的誘變及選擇方案。 如果起始細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)不成熟，不能再生整株，則不能進(jìn)行后續(xù)的各項操作。,體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)與選擇,1 體細(xì)胞變異誘導(dǎo)材

12、料的選擇 1.3 合適的細(xì)胞類型 適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型亦是提高體細(xì)胞突變系篩選效率的重要條件。,培養(yǎng)細(xì)胞的誘變,1 物理誘變 物理誘變主要是通過射線、磁場以及溫度等對培養(yǎng)物進(jìn)行一定處理，然后對處理后的培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)篩選。 常用的射線處理包括X射線、射線、快中子、紫外線等。,培養(yǎng)細(xì)胞的誘變,2 化學(xué)誘變 常用的化學(xué)誘變劑主要有：烷化劑（硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基黃酸乙酯 EMS，環(huán)氧乙烷EO，乙烯亞胺 EI等），此類誘變劑有一個或多個活化烷基，可與DNA分子中的堿基或磷酸基結(jié)合，改變DNA的結(jié)構(gòu)而引起突變。,培養(yǎng)細(xì)胞的誘變,2 化學(xué)誘變 堿基類似物（5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶類似物，2氨

13、基嘌呤是腺嘌呤類似物等），在細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制時，這些類似物可以摻入到新合成的DNA分子中引起錯配。,培養(yǎng)細(xì)胞的誘變,3 復(fù)合因子誘變 誘變處理可以是單因子處理，亦可以是復(fù)合因子誘變。一般來說，復(fù)合誘變的效果比單因子誘變好。,培養(yǎng)細(xì)胞的誘變,4 轉(zhuǎn)座子插入誘變 可以獨立插入通過其轉(zhuǎn)座功能誘導(dǎo)變異。 利用這一途徑已在苜蓿、馬鈴薯、番茄、甘藍(lán)等多種植物上獲得可利用的體細(xì)胞變異植株。,體細(xì)胞突變體的篩選,1 直接篩選法 直接篩選法是在設(shè)計的選擇條件下，能使培養(yǎng)細(xì)胞或再生個體獲得直接感官上的差異，因此能將突變個體和非突變個體分離。 最直接的做法是用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細(xì)胞能夠

14、生長，而非突變細(xì)胞不能生長，從而直接篩選出突變體。如抗除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質(zhì)。,體細(xì)胞突變體的篩選,2 間接篩選法 間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法。當(dāng)缺乏直接選擇表型指標(biāo)或直接選擇條件對細(xì)胞生長不利時，可考慮采用間接篩選法。,體細(xì)胞突變體的篩選,如脯氨酸（Pro）作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、細(xì)胞水分平衡等方面具有重要的生物學(xué)意義。植物在非生物脅迫如干旱、低溫等條件下，體內(nèi)Pro常常有不同程度的升高，而且耐干旱和耐寒植物的體內(nèi)Pro往往較高。,體細(xì)胞變異的利用,1 創(chuàng)造育種中間材料或直

15、接篩選新品種 據(jù)統(tǒng)計，誘導(dǎo)突變已被用來改良諸如小麥、水稻、大麥、棉花、花生和菜豆這些種子繁殖的重要作物。在全世界50多個國家中，已培育出1000多個由直接突變獲得的或由這些突變體雜交而衍生的品種。這些品種的主要特性包括品質(zhì)改良、增強(qiáng)抗病性和抗逆性等。,體細(xì)胞變異的利用,2 遺傳研究 突變體作為基因克隆和標(biāo)記篩選具有獨特的優(yōu)點。因為突變一旦發(fā)生，即可在表現(xiàn)型上與供體顯著不同，通過差異顯示或分子雜交篩選，即可快速獲得突變位點的DNA序列，經(jīng)過測序與功能鑒定，就可能獲得與突變性狀相關(guān)的基因。 即使通過分析不能獲得功能基因，這些DNA序列也可作為與突變性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，用于相關(guān)遺傳研究。,體細(xì)胞變異

16、的利用,3 發(fā)育生物學(xué)研究 植物的個體發(fā)育是一個漸進(jìn)過程，每一個器官和組織的分化都是一個復(fù)雜的調(diào)控過程。利用體細(xì)胞突變策略對植物發(fā)育的基因調(diào)控研究取得了突破性進(jìn)展。特別是利用擬南芥和金魚草等模式植物，已分離出一大批不同發(fā)育階段和組織類型的突變體，包括頂端分生組織、根、開花轉(zhuǎn)變、花序、花分生組織、胚胎發(fā)育等的一系列突變體。通過對這些突變體的研究，不僅建立了器官發(fā)育模式，而且分離鑒定了一大批與發(fā)育有關(guān)的基因，包括維持正常發(fā)育狀態(tài)的基因、促進(jìn)發(fā)育進(jìn)程的基因，以及相關(guān)修飾基因（許智宏和劉春明，1998）。,體細(xì)胞變異的利用,4 生化代謝途徑研究 生物的各種代謝活動涉及到一系列酶相關(guān)基因的表達(dá)。如果某一

17、代謝過程的關(guān)鍵酶基因突變，則會影響到下游代謝鏈的正常進(jìn)行。 因此，突變體作為代謝活動調(diào)控研究的工具，具有十分便利和高效的優(yōu)勢。,體細(xì)胞變異的利用,我們可以根據(jù)需要建立某一代謝途徑中每一個調(diào)節(jié)點的突變體，也可以根據(jù)需要與基因工程相結(jié)合，對一些關(guān)鍵調(diào)控過程進(jìn)行修飾和改造，使代謝過程按照人類需要進(jìn)行，因此而發(fā)展起來的新型學(xué)科領(lǐng)域稱之為代謝工程。,體細(xì)胞變異的利用,植物突變體用于代謝研究，早期最經(jīng)典的例子是通過煙草突變體對硝酸還原酶的研究。 硝酸還原酶缺失突變體有兩種類型：cnx和nia。兩種突變體具有同一表現(xiàn)型，即在以硝態(tài)氮為唯一氮源的培養(yǎng)基上不能生存。但將這兩種突變體的原生質(zhì)體融合后，融合細(xì)胞即可在只有硝態(tài)氮源的培養(yǎng)基上生長。由此說明，兩種突變體存在獨立的基因位點，而不同位點的基因又可能通過不同的途徑控制硝酸還原酶的活性。研究顯示。cnx和nia突變體分別通過影響鉬因子和酶蛋白來影響硝酸還原酶的活性。,小 結(jié),離體培養(yǎng)中遺傳的穩(wěn)定性是相