1、生物化學(xué)實驗內(nèi)容課程類型：制藥工程專業(yè)必修 實驗總學(xué)時：32課時開設(shè)實驗項目數(shù)：8個適用對象：2017制藥工程1、2班實驗教師：段志芳一、實驗?zāi)繕?biāo)及基本要求生物化學(xué)實驗是一門獨立的實驗課程，培養(yǎng)學(xué)生生物化學(xué)實驗基本操作技能、實驗數(shù)據(jù)處理能力、分析問題解決問題的能力和實事求是的科學(xué)態(tài)度。二、 實驗內(nèi)容序號實驗項目學(xué)時實驗要求實驗類別1植物組織中可溶性總糖的提取4必修驗證性實驗2蒽酮比色定糖法4必修驗證性實驗3卵磷脂的提取和鑒定4必修驗證性實驗4皂化價的測定4必修驗證性實驗5牛乳中酪蛋白的制備4必修驗證性實驗6蛋白質(zhì)濃度測定（考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法）4必修驗證性實驗7酵母RNA的提取4必修驗證性實驗8R

2、NA的定量測定（苔黑酚法）4必修驗證性實驗三、 成績包括實驗時的表現(xiàn)（實驗出勤、安全衛(wèi)生、操作對錯、損壞器皿情況等，占50%）及實驗報告的完成情況和完成質(zhì)量（占50%），每個實驗按總分為100分為滿分進(jìn)行打分，共8個實驗，總評取平均值。四、要求（1）實驗過程中同組人可以配合進(jìn)行；（2）實驗報告獨立完成，同組人數(shù)據(jù)相同，不得抄襲他組數(shù)據(jù)；（3） 實驗過程若出現(xiàn)失誤應(yīng)向老師匯報后再進(jìn)行重做；（4） 對實驗結(jié)果進(jìn)行簡單的分析.實驗一 植物組織中可溶性總糖的提取一、實驗?zāi)康?. 掌握可溶性總糖的概念和性質(zhì)。2. 掌握可溶性總糖提取的基本原理。3掌握溶解、過濾、洗滌、定容等基本操作技術(shù)。二、實驗原理可溶

3、性糖是指易溶于水的糖，包括絕大部分的單糖、寡糖，常見的有葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖等。它們在植物體內(nèi)可以充當(dāng)能量的儲存、轉(zhuǎn)移的介質(zhì)、結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能分子如糖蛋白的配基。總糖主要指具有還原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在測定條件下能水解為還原性的單糖的蔗糖、麥芽糖以及可能部分水解的淀粉?？扇苄钥偺翘崛》椒òǎ簾崴崛》?、酶提取法、超聲波提取法等。其溶于熱水，不溶于60%以上乙醇，所以用熱水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質(zhì)。本實驗利用可溶性糖溶于水的特性，將植物磨碎，用熱水將組織中的可溶性糖提取出來，結(jié)合實驗二得到總糖濃度，已知溶液體積和原料重量，可以求出總糖含量。三、實驗用品1. 儀器設(shè)備：電子

4、天平（精確到0.0g，配稱量紙若干）；可控溫電加熱板或電爐或電熱套或水浴鍋均可?？晒灿?。2. 玻璃器皿：研缽1套；100mL錐形瓶1個；25mL量筒1個；玻璃棒1根；100mL燒杯2個；膠頭滴管1支；過濾裝置1套（鐵架臺1臺+鐵圈1個+玻璃漏斗1個+100mL容量瓶1個+洗瓶1個）；不銹鋼刮勺1個；剪刀1把。此部分為每組所用，集中到小框里，放置各實驗臺上。3. 藥品試劑：新鮮植物葉片；蒸餾水。4. 其他：9cm濾紙若干（與玻璃漏斗配套）；紙巾若干；標(biāo)簽紙若干。每個洗手池常規(guī)配置燒杯刷、毛巾、洗手液。四、實驗操作取新鮮植物葉片，洗凈表面污物，用濾紙吸去表面水分。稱取0.5g，剪碎，加入510ml

5、蒸餾水，在研缽中磨成均漿，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，用蒸餾水少量多次沖洗研缽，洗出液也轉(zhuǎn)入錐形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷卻后過濾到100ml容量瓶中，同法殘渣再提取23次，將提取液合并至容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。貼好標(biāo)簽，保存至冰箱中，用于實驗二。五、實驗結(jié)果與討論1、觀察產(chǎn)品顏色是否與理論相符，若不符合，分析原因。2、結(jié)合實驗二結(jié)果計算含量六、實驗注意事項（1） 若有干擾，可滴加飽和中性醋酸鉛以除去溶液中的蛋白質(zhì)，乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質(zhì)，若色素較多可脫脂。（2） 加熱時應(yīng)小心，避免灼傷皮膚。七、思考題1、可溶性糖在植物物質(zhì)代謝中的作用。2、用水提取的糖類有哪些？實驗二

6、蒽酮比色法測定可溶性總糖含量一、 實驗?zāi)康?、 掌握蒽酮比色法測定可溶性總糖的原理和方法2、 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3、 掌握分光光度計的使用方法二、實驗原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量測定。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等(因為反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng))，所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有

7、色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為 620 nm ，故在此波長下進(jìn)行比色。三、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備1、儀器分光光度計（配玻璃比色皿、擦鏡紙、注明廢液回收的具塞廣口瓶、洗瓶）；電子天平（配稱量紙）；離心機(jī)（配離心管），恒溫水浴鍋。2、玻璃器皿0.5mL、1 mL、5 mL刻度吸管各2支（配合適大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度試管10支（應(yīng)干凈干燥，放到試管架上）；100 mL燒杯2個；10 mL量筒1個；玻璃棒1根；長膠頭滴管1根。此部分為每組所用，放置各實驗臺上。3、試劑：（1）（3）由實驗員配制，貼好標(biāo)簽（1）80 %乙醇（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液( 100 g/mL )：準(zhǔn)確稱取 100 mg 分

8、析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至 1000 mL。（3）蒽酮試劑：稱取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 濃硫酸(將 98% 濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中) 1000 mL中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶內(nèi)，冰箱保存，可使用 2 3 周。（4）樣品貯備液：學(xué)生實驗一所得可溶性總糖提取物水溶液。 四、實驗步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取6支試管，從0 5分別編號，按下表加入各試劑：表 蒽酮法測可溶性糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量管 號012345100 g/mL 葡萄糖溶液( mL )00.20.40.60.81.0蒸餾水( mL )1.00.80.60.40.20蒽酮試劑( mL )5.05.05.0

9、5.05.05.0葡萄糖量( g )020406080100將各管快速搖動混勻后在沸水浴中煮 10 min，取出冷卻，在 620 nm 波長下用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，含葡萄糖量( g )為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品測定 將樣品貯備液用蒸餾水稀釋到合適范圍，取該溶液 1.0 mL 加蒽酮試劑 5 mL，同以上操作顯色測定光密度。重復(fù) 3 次。 按照下式計算可溶性總糖的含量：w=nm1 V1V2 / m2100%式中：w-表示總糖含量n-稀釋倍數(shù)m1-從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖量, g .m2-樣品重( g ).v1-提取物總體積（ml）v2-測定時樣品體積（ml）五、結(jié)果與討論：1繪制出

10、標(biāo)準(zhǔn)曲線2含量的計算六、實驗注意事項（1）加濃H2SO4時應(yīng)緩慢加入，以免產(chǎn)生大量熱量而爆沸，灼傷皮膚，如出現(xiàn)上述情況，應(yīng)迅速用自來水沖洗。（2）水浴加熱時應(yīng)打開試管塞。七、思考題1、植物組織中糖的測定方法還有哪些？舉例說明其原理和優(yōu)缺點？2、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意哪些問題？實驗三 卵磷脂的提取與鑒定一、 實驗?zāi)康?、掌握磷脂類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。2、掌握卵磷脂的提取鑒定的原理和方法。3、掌握乙醇做溶劑提取的操作技術(shù)。二、實驗原理磷脂是生物體組織細(xì)胞的重要成分，主要存在于大豆等植物組織以及動物的肝、腦、脾、心等組織中，尤其在蛋黃中含量較多(10%左右)。卵磷脂和腦磷脂均溶于乙醚而不溶于丙酮，利用此

11、性質(zhì)可將其與中性脂肪分離開；此外，卵磷脂能溶于乙醇而腦磷脂不溶，利用此性質(zhì)又可將卵磷脂和腦磷脂分離。新提取的卵磷脂為白色，當(dāng)與空氣接觸后，其所含不飽和脂肪酸會被氧化而使卵磷脂呈黃褐色。卵磷脂被堿水解后可分解為脂肪酸鹽、甘油、膽堿和磷酸鹽。甘油與硫酸氫鉀共熱，可生成具有特殊臭味的丙烯醛；磷酸鹽在酸性條件下與鉬酸銨作用，生成黃色的磷鉬酸沉淀；膽堿在堿的進(jìn)一步作用下生成無色且具有氨和魚腥氣味的三甲胺。這樣通過對分解產(chǎn)物的檢驗可以對卵磷脂進(jìn)行鑒定。三、儀器和試劑1、儀器設(shè)備電子天平(精確到0.00g，配9cm稱量紙)；減壓蒸餾裝置（旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀+水循環(huán)真空泵+相應(yīng)橡膠管，用前由實驗員檢查是否正常；配5

12、00mL24#磨口蒸餾和接收圓底燒瓶，2500mL磨口具塞廣口瓶上標(biāo)注回收乙醇，與儀器同臺放置，提取時重復(fù)使用）。此部分共用。2、玻璃器皿回流裝置一套（500mL 恒溫磁力攪拌電熱套(配2cm磁子)1臺+250 mL24#磨口圓底燒瓶1個+24#磨口球形冷凝管1根+橡膠管2根+鐵架臺1個+鐵夾2個）；過濾裝置一套（鐵架臺1個+鐵圈1個+玻璃漏斗1個+250 mL24#具塞磨口錐形瓶1個+18cm定性濾紙若干）；100 mL量筒各一個；100 mL燒杯一個；玻璃棒1根；長膠頭滴管1個；長藥勺1個；試管2支；蒸發(fā)皿1個。此部分為每組所用，放置各實驗臺上。3、藥品試劑（3）由實驗員配制，貼好標(biāo)簽。（

13、1）雞蛋黃（2）95%乙醇（3）10%氫氧化鈉溶液4、其它：紅色石蕊試紙若干；剪刀2把；一次性手套若干；紙巾若干；標(biāo)簽紙若干。每個洗手池常規(guī)配置燒杯刷、毛巾、洗手液。四、操作步驟1、卵磷脂的提取 取250 mL24#磨口圓底燒瓶，放入2cm的磁力攪拌子，加入蛋黃20 g和95%乙醇60 mL，攪拌加熱，稍冷后過濾到250 mL具塞磨口錐形瓶中，蓋好塞子，濾渣同法提取23次，合并提取液，如濾液仍然混濁，可重新過濾直至完全透明。提取液減壓蒸餾至少量，回收乙醇（放入回收瓶中），將剩余物用長膠頭滴管轉(zhuǎn)移置于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴鍋中蒸干，所得干物即為卵磷脂。稱重并計算得率。2、卵磷脂的鑒定 取干燥試管一支，加

14、入少量提取的卵磷脂以及25mL 氫氧化鈉溶液，放入水浴中加熱15min，在管口放一片紅色石蕊試紙，觀察顏色有無變化，并嗅其氣味。五、結(jié)果與分析1、觀察產(chǎn)品的顏色外觀2、計算產(chǎn)率3、鑒定結(jié)果六、思考題：1、卵磷脂的生物學(xué)功能有哪些？2、卵磷脂提取過程中，加入95%乙醇的作用是什么？實驗四 脂肪皂化價的測定一、目的1、 掌握油脂的主要理化性質(zhì)2、掌握油脂皂化價的測定原理和方法。3、掌握滴定分析法的操作二、原理脂肪的堿水解稱皂化作用。皂化1g 脂肪所需的KOH 的毫克數(shù)稱為皂化價。脂肪的皂化價與相對分子質(zhì)量成反比，由皂化價的數(shù)值可知混合脂肪的平均相對分子質(zhì)量。三、儀器、試劑和材料1、儀器設(shè)備：電子天

15、平(精確到0.000g，配5 ml稱量瓶)。2、玻璃器皿：回流裝置一套（500mL 恒溫磁力攪拌電熱套(配2cm磁子)1臺+250 mL24#磨口圓底燒瓶1個+24#磨口球形冷凝管1根+橡膠管2根+鐵架臺1個+鐵夾2個）；酸堿滴定管1支；50ml量筒1個；磨口具塞錐形瓶2只；100ml燒杯1只；玻棒1根。此部分為每組所用，放置各實驗臺上。3、藥品試劑：（2）（5）由實驗員配制，貼好標(biāo)簽。（1）豆油（2）0.100mol/L 氫氧化鈉乙醇溶液：以0.100mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液標(biāo)定。（3）0.100mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液：取濃鹽酸8.5ml ，加蒸餾水稀釋至1000ml, 然后對此溶液進(jìn)行標(biāo)定。

16、（4）70%乙醇：取95%乙醇70 ml，加蒸餾水稀釋至95ml。（5）1%酚酞指示劑：稱取酚酞1g，溶于100ml 95%乙醇。四、操作步驟1. 在天平上稱取脂肪0.5g 左右，置于250ml 圓底燒瓶中，加入0.1mol/LNaOH乙醇液50ml。裝上冷凝管回流30-60min，至瓶內(nèi)的脂肪完全皂化止（此時瓶內(nèi)液體澄清并無油珠出現(xiàn)，若乙醇被蒸發(fā)，可酌情補(bǔ)充適量70%乙醇。2. 皂化完畢，冷至室溫，加1%酚酞指示劑2滴，以0.1mol/LHCl液滴定剩余的堿（HCl 用量少可用微量滴定管），記錄鹽酸用量。另作一空白實驗，除不加脂肪外，其余操作均同上，記錄空白實驗鹽酸的用量。五、結(jié)果計算皂化價

17、=（a-b ）c56/Wa ：空白實驗所消耗的HCl 的毫升數(shù)。 b：脂肪實驗所消耗的HCl 的毫升數(shù)。 C：HCl的濃度，0.100mol/LW：脂肪的重量。56：KOH 的摩爾質(zhì)量g/ ml。六、注意事項1、皂化所用試劑一定要標(biāo)準(zhǔn)，所用樣品量要準(zhǔn)確。2、實驗過程應(yīng)避免污染和干擾。七、思考題1. 什么是皂化價？它有何意義？2、如何檢驗油脂已皂化完全。實驗五 牛奶中酪蛋白的制備一、目的與要求1、掌握從牛乳中分離酪蛋白的原理和方法2、掌握等電點沉淀法提取蛋白質(zhì)的方法3、掌握離心、洗滌等實驗操作技術(shù)二、原理蛋白質(zhì)是一種親水膠體，在水溶液中蛋白質(zhì)分子表面形成一個水化層。另外，蛋白質(zhì)又是一種兩性離子，

18、在一定pH溶液能夠維持一個穩(wěn)定的狀態(tài)。但是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值至等電點時，蛋白質(zhì)會因失去電荷而變得不穩(wěn)定，此時若再加脫水劑或加熱，水化層被破壞，蛋白質(zhì)分子就相互凝聚而析出。等電點沉淀法主要利用兩性電解質(zhì)分子在等電點時溶解度最低的原理，而多種兩性電解質(zhì)具有不同等電點而進(jìn)行分離的一種方法。牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點為4.7。將牛乳的pH調(diào)至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀，除去脂類雜質(zhì)后便可得到較純的酪蛋白。三、實驗用品1、 儀器設(shè)備離心機(jī)（配10ml或15ml離心管），恒溫水浴鍋。2、 玻璃器皿50 mL燒杯1只，25mL燒

19、杯2只，10 mL具塞刻度試管1支，10mL量筒1支，玻璃棒1支，長膠頭滴管2支。此部分為每組所用，放置各實驗臺上。3、 藥品試劑：（2）（3）由實驗員配制，貼好標(biāo)簽。（1）牛奶（2）0.2mol/L的pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液（3）0.2mol/L氫氧化鈉溶液（4）冰醋酸（5）95%乙醇4、其它：精密pH試紙；一次性手套若干；紙巾若干；標(biāo)簽紙若干。每個洗手池常規(guī)配置燒杯刷、毛巾、洗手液。四、方法和步驟1、取預(yù)先放冰箱中冷卻的消毒牛奶6mL，3 000r/min離心10min，除去脂肪層的乳液置50毫升燒杯內(nèi)，加熱至40左右，在攪拌下慢慢加入10mL左右預(yù)熱的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用冰醋酸調(diào)節(jié)

20、pH=4.7，此時混濁液中有大量絮狀物沉下。冷至室溫，3000r/min離心10min，棄去上清液，得酪蛋白粗品。2、用蒸餾水洗沉淀三次（每次5mL左右），3000r/min離心10min，棄去上清液。3、將沉淀加5mL 95%乙醇洗滌，離心后所得沉淀風(fēng)干，得酪蛋白制品（稱重，記錄）。4、酪蛋白溶液的配制：稱取酪蛋白0.01g，置25毫升燒杯中，加5mL 0.2mol/L氫氧化鈉溶液，攪勻， 隔水加熱，溶解后轉(zhuǎn)移至10毫升容量瓶中，用少量蒸餾 水洗燒杯數(shù)次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度處，搖勻，置冰箱中保存，實驗六備用。五、結(jié)果與計算計算酪蛋白含量和得率：1、含量：酪蛋白克數(shù)/100mL牛

21、奶2、 式中理論含量3.5g/100mL牛奶六、注意事項1、離心機(jī)的使用安全：（1）使用前，離心管和離心物一定要對稱平衡；（2）離心開始時，設(shè)置好了轉(zhuǎn)速和時間，一定要等到轉(zhuǎn)速穩(wěn)定了后，人才能離開；（3）離心結(jié)束，只有儀器報警了，且轉(zhuǎn)速完全為零后，才能打開離心機(jī)蓋。七、思考題1、酪蛋白的理化性質(zhì)2、酪蛋白的生物學(xué)功能有哪些？實驗六 考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)濃度一、 目的 1、學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250 測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2、掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析方法 3、熟練掌握分光光度計的使用方法二、原理 考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250 在游離

22、狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm 波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250 結(jié)合在2min 左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h 內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford 建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為01 000gmL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。 三、材料、主要儀器和試劑 1儀器：分光光度計（配玻璃比色皿、擦鏡紙、注明廢液回收的具塞廣口瓶、洗瓶）2. 玻璃器皿：0.1

23、mL、1 mL刻度吸管各2支（配合適大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度試管10支（應(yīng)干凈干燥，放到試管架上）；100 mL燒杯2個，10 mL量筒1個；玻璃棒1根；長膠頭滴管1根。此部分為每組所用，放置各實驗臺上。3試劑： （1）（3）由實驗員配制，貼好標(biāo)簽。（1）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸餾水中，即為1 000gmL 的原液。 （2）考馬斯亮藍(lán)G-250 的配制：稱取100mg 考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL。此溶液在常溫下可放置一個月。 （3）0.9%Na

24、Cl（4）樣品貯備液：實驗五所得粗蛋白堿水溶液四、操作步驟 1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 （1）0100gmL 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6 支10mL 干凈的具塞試管，按表1 取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min 后用1cm比色杯在595nm 波長下比色，記錄各管測定的光密度OD595nm，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 表1 低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 （2）01 000gmL 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：另取6 支10mL 具塞試管，按表2 取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為01 000gmL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 表2 高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 2樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定 （1）待測樣品制備：將樣品貯備液用0.9%NaCl合

25、適稀釋至可測定范圍，即得待測樣品水溶液。 （2）測定：另取2 支10mL 具塞 試管 ，按下表取樣。吸取提取液0.1mL（做一重復(fù)），放入具塞刻度試管中，加入5mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 蛋白試劑，充分混合，放置2min 后用1cm比色杯在595nm 下比色，記錄光密度OD595 nm，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（g）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線1 號試管做空白。 五、結(jié)果計算 1繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線2含量的計算 式中：X 為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（g）。 若樣品溶液經(jīng)過稀釋，則最后結(jié)果要乘以稀釋倍數(shù)。六、注意事項 1蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250 結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，在2min 左右反應(yīng)

26、達(dá)到平衡；其結(jié)合物在室溫下1h 內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測定時，不可放置太長時間，否則將使測定結(jié)果偏低。 2. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定樣品時，要將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，目的是使反應(yīng)充分，并且使整個反應(yīng)液均一，否則在比色測定時，結(jié)果會有較大偏差，使標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)的測定結(jié)果就不可靠。七、思考題 1 蛋白質(zhì)濃度可以用哪些方法測定？參考答案：蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如比重、紫外吸收、折射率等測定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、Folin酚試劑反應(yīng)等方法來計算；也可以用染色法，如氨基黑、考馬斯亮藍(lán)法測定；還可以用熒光激發(fā)法、氰胺、放射性同位素計數(shù)等靈敏度較高的方法。 實驗七 酵

27、母RNA的提取一、實驗?zāi)康模?、掌握RNA的理化性質(zhì)2、掌握稀堿法提取RNA的原理與技術(shù)。二、實驗原理：工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這2種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡單。稀堿法使用稀堿（本實驗用0.2%NaOH溶液）使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA（本實驗）或調(diào)pH2.5利用等電點沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA達(dá)2.6710.0%，而DNA含量僅為0.030.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。結(jié)合實驗八得到RNA濃度，已知溶液體積和原料重量，可以求出RNA含量。三、實驗用品：

28、1儀器：電子天平（0.00g，配稱量紙）；離心機(jī)（5000rmin-1，配離心管）；水浴鍋或可控溫加熱設(shè)備2. 玻璃器皿100ml燒杯1個；10ml量筒3個；長膠頭滴管3支；玻璃棒1根。此部分為每組所用，放置各實驗臺上。3試劑：（2）由實驗員配制，貼好標(biāo)簽。（1）干酵母粉（市售）（2）0.2%氫氧化鈉溶液：2gNaOH溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。（3）乙酸（AR）。（4）95%乙醇。4. 其它pH試紙（pH110）；濾紙；紙巾若干；標(biāo)簽紙若干。四、操作步驟：置1g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液10ml，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試

29、紙），離心1015分鐘（4000rmin-1）。取上清液，加入95%乙醇8ml，邊加邊攪。加畢，靜置，離心。用膠頭滴管吸去上清液，沉淀再用95%乙醇洗2次（每次約2.5ml），洗滌時可用細(xì)玻棒小心攪動沉淀。沉淀即為粗RNA，將其用蒸餾水溶解后定容，貼好標(biāo)簽，保存至冰箱中，用于實驗八。五、實驗結(jié)果與討論1、觀察產(chǎn)品顏色是否與理論相符，若不符合，分析原因。2、結(jié)合實驗八計算含量六、注意事項1、沉淀有時出現(xiàn)較慢，可多放置一些時間。七、思考題1、RNA的提取制備方法主要有哪些？參考答案：由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗室最常用的。

30、組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。實驗八 苔黑酚法測定核酸含量一、 實驗?zāi)康?、 掌握苔黑酚法測定RNA含量的基本原理和具體方法。2、 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析方法3、 熟練使用分光光度計二、實驗原理 RNA含量測定除可用紫外吸收法及定磷法外，常用苔黑酚法測定。其反應(yīng)原理是：當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3,5-二羥基甲苯（苔黑酚，又名地衣酚orcinol）反應(yīng)，在Fe 3+或Cu 2+催化下，生成鮮綠色復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收。RNA濃度在20250gml-1范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度成正比。三、實驗用品1儀器分光光度計（配玻璃比色皿、擦鏡紙、注明廢液回收的具塞廣口瓶、