1、第5章 同位素分析技術(shù),中國農(nóng)業(yè)大學 齊孟文,第5章 同位素分析技術(shù) 5.同位素稀釋分析方法(Isotope dilution analysis,ID) 1.直接稀釋法 由稀釋前后總活度不變,有: 只需部分分離，測定 Sm。,例題 測定152.6mg蛋百質(zhì)水解液中甘氨酸的含量。為此，將比活度為96.2cpm/mg的5.07mg14C-甘氨酸加到水解液，混均后分離出部分純的甘氨酸，測得其比活度51.3cpm/mg。 則 ,2.反向同位素稀釋(inverse isotope dilution analysis) 又稱逆稀釋，用于測定射性物質(zhì)，分析公式： 則，,例題 測定小球藻14CO2光合作用生成

2、的14C-蛋白質(zhì)中谷氨酸的含量。為此，取適量14C-蛋白質(zhì)水解，從中分離出部分純的谷氨酸，測得其比活度為254dpm/mg.在同樣試樣的水解液中，加入10.7mg非標記谷氨酸，混合均勻后，分離出部分純的谷氨酸，測得其比活度為191dpm/mg。 則,3.亞化學計量稀釋法(substiochiometry istope dilution analysis) 從稀釋系統(tǒng)和示蹤劑原液分離出等量的化合 物，同時測量，則因 有： 等量分離可利用，難溶化合物的溶解度一定，一定電量下電解質(zhì)的析出量一定，吸附劑的飽和吸附量一定，不足萃取劑的飽和萃取量一定等性質(zhì)。,4.改進的亞化學劑量法(improved su

3、bstiochiometry istope dilution analysis) 1）定量示蹤法 在分析樣品時，同時取含待測物已知的標樣，分別加入等量的標記物，則：,若 則 若用亞化學劑量法分離出等量待測物， 則 該法不必知道所加入標記物的量w0，從而避免由其因質(zhì)量小不易準確測量產(chǎn)生的誤差。,2)平行稀釋法 該法與上法類似，但當標記物的加入量不能忽略時，分析時，可取兩份等量樣品wx，分別加入不同量的標準待測物w1和w2，然后再加等量標記物，此時其量可忽略，因此： 若采用亞化學計量法分離，使 ， 有 則,5. 在現(xiàn)代儀器尤其是質(zhì)譜分析中，同位素稀釋法常作為一種內(nèi)標計量分析的手段。 舉例 Max

4、haldimann et al. Direct determination of yrinary iodine by inductively coupled plasma mass spectrometry using isotope dilution whih iodine-129.Clinical chemistry1998;44(4):817-824 碘是合成人體甲狀腺激素所必需微量營養(yǎng)元素，甲狀腺激素在為維持機體能量代謝，促進人體骨骼發(fā)育，腦發(fā)育和垂體的支持作用中具有重要的生理作用，在碘缺乏地區(qū)，推行加碘鹽是預防碘缺乏疾病的國家行動，測定尿碘的濃度是指導補碘的基本依據(jù)，而129I同位素

5、稀釋ICPMS是一種最準確的測定尿碘的方法。,理論： 碘是單同位素元素，核素為127I，為此只能以其長壽命的放射性同位素129I作為內(nèi)標。樣品添加內(nèi)標后，混合物中碘同位素核素的原子個數(shù)比，相應于ICP-MS測定的129I與127I的強度比值R，即 式中，n為碘的摩爾數(shù)，a為碘的同位素127或129的豐度，下角標s和u分別代表內(nèi)標和尿樣。,重排上式，并假設(shè) ，則尿樣中未知 碘的摩爾數(shù)為 考慮到質(zhì)譜過程可能發(fā)生同位素質(zhì)量歧視效應，使得測定的R值帶有系統(tǒng)偏差，應引入一系統(tǒng)校正因子f,該因子可由對確切知道同位素構(gòu)成的標樣測定而確定，即,式中，Rtrue是標準中確切已知的同位素比值，而 Rexp是質(zhì)譜實

6、際測定的同位素比值。 最終，用ICP-MS測定尿碘的同位素稀釋計量關(guān)系式為,5.2 體外放射分析(in vitiro radioassay) 在體外條件下，以放射性標記的配體為示蹤劑，以競爭或非競爭性免疫結(jié)合為基礎(chǔ)，以放射性檢測為定量手段的超微量物質(zhì)分析技術(shù)。 競爭 放射免疫分析 抗體-抗源 非競爭 免疫放射分析 類型 結(jié)合蛋白-激素 競爭性結(jié)合蛋分析 受體- 配體 競爭性受體-體配體分析,1.放射免疫分析(Radioimmunoassy,RIA) 建立在待測抗原物質(zhì)對標記抗原與限量特異 性抗體的結(jié)合競爭抑制基礎(chǔ)上的將免疫學反應高 度特異性與放射性測量高度靈敏性相結(jié)合的一種 超微量分析方法。

7、特點：靈敏度高(10-9 10-12g)，特異性強， 重現(xiàn)性好，抗體可用免疫學方法根據(jù)需要制備。,1)基本概念 抗原(Antigen,Ag) 能刺激動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體(免疫原性) ，并與所產(chǎn)生的抗體能特異性結(jié)合(反應原性)的物質(zhì)。 抗原決定簇（Antigenic determinant) 在抗原分子表面決定抗源與抗體特異性作用的特殊基團，又稱為表位(epitope)。 半抗原 (hapten) 具有反應原性而不具有免疫原性的小分子物質(zhì)。,人工抗原(Artificial antigen) 把半抗原與載體蛋白分子(人、牛血清蛋白)共鍵結(jié)合形成的抗原物質(zhì)。 標記抗原(Labelled antig

8、en) 被放射性核素標記的抗原。 抗體(Antibody,Ab) 由抗原刺激動物機體產(chǎn)生的免疫球蛋白，存在于血清中，所以常又稱為抗血清，能與相應的抗原特異性結(jié)合。,2)基本反原理 *Ag+Ab *Ag.Ab F + B Ag Ag . Ab Ag（應變量）與*Ag .Ab（自變量）間存在著逆函數(shù)關(guān)系，可予以定量。,K1,K2,定量關(guān)系演釋,Ag *Ag Ab Bound Free B F B/F,0.67,0.33,1,0.50,0.50,2,0.5,0.33,0.67,0.2,0.17,0.83,競爭放射分析原理示意圖,3）基本試劑 標準抗原 用于測定反應劑量曲線或制備標記抗原，純 度應90

9、%。 標記抗原 多肽類抗原常用碘標 原理 用氧化劑如氯胺T使 I*- 氧化成 I*，然后去取代肽分子中酪氨酸殘基苯環(huán)上的氫原子。 ,抗體 免疫制備途徑： 1）人工抗原的制備 具有重要生物意義的小分子半抗原 植物激素 生物活性物質(zhì) 藥物(農(nóng)藥) 半抗原+蛋白質(zhì)載體(HSA，BSA) 蛋白半抗原,偶聯(lián)劑 激活羧基(半抗原上)使之與氨基(蛋白上)縮合生成(CONH)。 在氨基間搭橋。 能在酪氨酰，組氨?；蛸嚢滨埢g搭橋的雙功能重氮鹽。, 碳二亞胺法, 混合酸酐法, 戊二醛法, 琥珀酸酐法, 重氮化的對氨基苯甲酸法,2）抗血清的免疫制備 用抗原接種免疫動物，其成熟的B細胞克隆受到抗原刺激后，產(chǎn)生分泌

10、并分泌特異抗體到血清和體液中。實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。,鑒定： a. 滴度血清中抗體的濃度。定義為B/T%50%時抗血清的稀釋倍數(shù)。 b. 特異性抗原抗體反應的專一程度。特異性高，則抗干擾能力強。用抗原類似物交叉反應率描述。在Ab和Ag*一定下，分別測定抗源及其類似物的反應劑量曲線B/B0%-f(Ag),求出B50后按下式計算 交叉反應(%) C. 親合力抗原抗體結(jié)合強度。由平衡常數(shù)衡量決定，親和力強，檢測靈敏度高。,3）單克隆抗體Monoclonal antibody,McAb: 由單個B細胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體。 制備過程 1.致

11、敏淋巴細胞的準備； 2.骨髓瘤細胞的準備； 3.細胞融合； 4.選擇性培養(yǎng)； 5.抗體分泌細胞的篩選； 6.克隆化過程； 7.單克隆抗體的制備取,抗原,致敏淋巴細胞,骨髓瘤 細胞,融合,選擇性 培養(yǎng),抗體分泌細胞篩選,克隆化,單抗制取,單抗純化,單抗鑒定,致敏淋巴細胞,骨髓瘤細胞,離心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培養(yǎng)液 10ml,離心 1000rpm 7min,37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi),HAT選擇培養(yǎng)原理,核苷酸從頭合成途徑（de novo synthesis）,核苷酸補救合成途徑（salvage synt

12、hesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黃嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,次黃嘌呤核 次黃嘌呤（H） 單磷酸 A 嘌呤類核苷酸 糖氨基酸 核苷酸 DAN 核苷酸 嘧啶類核苷酸 胸腺嘧啶核苷 胸腺嘧 單磷酸 啶核苷（T） A：氨基碟呤，葉酸拮抗物；TK：胸腺嘧啶核苷激酶； HGPRT次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)換酶,HGPRT,TK,內(nèi)源合成,外源合成,細胞組合 HGPRT 生長狀態(tài) 淋巴細胞 + 骨髓瘤 + 長期生長 淋巴細胞 + 淋巴細胞 + 短期生長 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生長 未融合淋巴細胞 + 短期生長 未融合骨髓瘤 不能生長,選擇培養(yǎng)的細胞類型 骨髓瘤細胞（HGPRT-，或T

13、K-),淋巴細胞（ HGPRT+，或TK+）,HGPRT；次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)換酶；TK:胸腺嘧啶核苷激酶,有限稀釋克隆法,計數(shù),103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,單克隆抗體的制取與鑒定 制?。?體外培養(yǎng)罐法 體內(nèi)腹腔接種 純化： 鹽析、層析、制備型HPLC 鑒定： 特征鑒定Ig類型、親和力、效價、特異性 決定簇鑒定是否針對同一決定簇,分離試劑 使游離抗原與抗原-抗體復合物相互分離的試劑。,超微量的抗體-抗原復合一般不沉淀，需加入沉淀劑使其與游離抗原分離，才能分別測定。 雙抗法 一抗與抗原(標記+待測)溫育，平衡后，加大量二抗使一抗-抗原復合物沉淀，離心分離進行測定。

14、 ,吸附法 萄聚糖炭末法，炭粒外包以萄聚糖構(gòu)成沉淀劑，小分子可通過萄聚糖的篩孔被活性碳吸附，而抗原一抗體被拒留在反應液中，通過離心可使二者分離。,固相法 抗體被包被或交聯(lián)在固體表面，形成固相抗 體，抗原與固相抗體溫育平衡后，傾去反應液， 洗滌固相表面，即可達到分離目的。,4）應用舉例 牛奶中孕酮含量的RIA測定 用于妊娠和卵巢機 能疾病診斷。 試劑和儀器 1)測定藥盒 3H標孕酮15000dpm/0.05ml，抗體 (1100)。 2)水溶性閃爍液，液閃。 3)萄聚糖炭末(DCC)及磷酸鹽緩沖液(PBS)。 4)供試奶樣。 , 操作步驟 測試奶樣 取0.1ml全奶用PBS稀釋至1ml，再取0.

15、1ml供試。 對照奶樣(孕酮極低)，準備同上。 反應劑量標準8ng標準孕酮加入0.5mlPBS，取0.05ml即得800pg，連續(xù)稀釋至400，200，50，25pg。 抗體0.1ml，用6ml PBS稀釋(16000)。 分析過程見表,奶樣中孕酮的RIA,奶樣中孕酮的RIA,樣中孕酮的RIA,振蕩1min； 迅速放入營40C冰水浴靜止10min； 離心 10min(3000r/min)； 倒出上清液至盛5ml閃爍液瓶中，經(jīng)24h后測 定。,奶樣中孕酮的RIA 注： NSB非特異結(jié)合率，測定結(jié)果用作本底。B0 零管結(jié)合率，為不加待測孕酮時相應的標記孕 酮的最大結(jié)合率。,2.免疫放射分析（Imm

16、unoradiometric assay,IRMA) 基于過量標記抗體Ab* 對待測抗原的非競爭性免疫結(jié)合全量放射測量的微量分析方法。 Ag+*Ab=Ag.*Ab+*Ab,結(jié)合率（%）,Ag劑量,RIA,IRMA和RIA曲線形態(tài)比較,IRMA,IRMA和RIA的比較,IRMA的主要優(yōu)點 穩(wěn)定性好、靈敏度佳 1.標記抗體穩(wěn)定性比標記抗原好 2.可以檢測到10-15/g 3.溫育的影響小 IRMA應用主要限制 1.不適宜測定小分子物質(zhì) 2.需要大量的抗體，直到單克隆抗體的產(chǎn)生才得以普及推廣。,3放射受體-配體分析基礎(chǔ) 受體是指在生物系統(tǒng)中，在細胞表面存在的介導信號傳遞的，與其內(nèi)源性配基，如神經(jīng)遞質(zhì)

17、、激素、免疫因子、生長因子等結(jié)合并啟動后續(xù)反應的特定物質(zhì)。 放射受體配體分析，可以通過對受體進行定位顯像或定量測定，以研究其生理與藥理學效應。如神經(jīng)遞質(zhì)、激素的作用機制，細胞水平的調(diào)控機制、疾病藥理的機制等。,1.質(zhì)量作用定律 式中，R,L為游離受體和配基的濃度，RL為復合物濃度。 2.飽和曲線 對與一定數(shù)量（RT)固定）和一定親合力（Kd固定）的受體，隨配基濃度上升，培基結(jié)合物RL先快后慢上升，最后達到飽和，所有受體都被結(jié)合。,3.Scatchard作圖 重排: 得著名的Scatchard函數(shù) 當RT和Kd固定，RL/L-RL是線性關(guān)系，其斜率為1/Kd,即親合常數(shù)的倒數(shù)，橫截距為RT,即受

18、體數(shù)量。,4.Hill函數(shù)及系數(shù) 若受體有多于1個以上的配基結(jié)合位點，則 上式直線的斜率稱為Hill系數(shù)。若受體：配基=1：1，則n=1;若受體：配基=1:2,則n=2。,4.非放射性碘標記-電感耦合等離子體質(zhì)譜免疫分析體系 以非放射性127I為標記原子，采用溴代琥珀酰胺(NBS)法，對含有絡(luò)氨酸殘基的抗原或抗體進行標記，制得127I標記抗體或抗原。免疫反應測定時，將結(jié)合的標記物與游離的標記物分離后，用用稀氨水溶液將碘洗脫并經(jīng)ICP-MS檢。 該體系標記反應步驟簡便，標記率高、標記物穩(wěn)定、活性好，無放射性危害。同時，用ICP-MS檢測，盡管鹵素的電離電位較高，但碘的第一電離能為1045 eV，

19、在氬等離子體中只能達到大約25的電離，和其他分析方法相比，還是具有比較高的靈敏度。 參考文獻：李景喜等. 非放射性碘標記一電感耦合等離子體質(zhì)譜用于免疫分析研究. 植物生態(tài)學報,2010, 34 (2): 170178,5.非放射性標記免疫分析技術(shù) 1)酶聯(lián)免疫分析（enzyme immunoassay,EIA) 用酶作為標記物標記抗原（抗體），以酶促底物反應產(chǎn)物 的顏色作為檢測信號的免疫分析方法。 酶及底物：辣根過氧化酶鄰苯二胺 堿性磷酸酶P-硝基酚磷酸鹽 測定模式: 競爭性 非競爭性,免疫分析類型（用途，分離及分析技術(shù)） 免疫測定 均相 （Ab-AgE酶活性改變，與AgE相區(qū)分） (不分離F

20、與B) 液相（EIA) 非均相 標記抗原 類型 （分離F與B) 固相（ELISA) 標記抗體 光鏡水平 免疫組化 電鏡水平 酶標測定簡便，使用范圍較廣，但因酶反應對環(huán)境條件敏感， 定量性較差。,非均相液相法 非均相固相法（固定抗原）,均相酶標抗原,2)化學發(fā)光免疫分析（chemical luminescent immunoassay,CLIA） 用某些發(fā)光物質(zhì)標記抗原（抗體），當其被氧化時，可被化學反應激發(fā)而發(fā)光，以其發(fā)光作為檢測信號的免疫測定法。 直接化學發(fā)光物質(zhì)標記法 標記物為吖啶脂，該類化合物結(jié)構(gòu)上都有吖啶環(huán)，在過氧化氫陰離子（HO-2)作用下，形成電子激發(fā)態(tài)中間體N-甲基吖啶酮，其退激

21、是放出=395nm,430nm的光子。,酶標化學發(fā)光分析 以過氧化酶作為標記，發(fā)光物質(zhì)作為酶的底物的免疫分析。 a.氨基鄰苯二甲酰肼類 如魯米諾，異魯米諾，在酶和啟動發(fā)光劑（NaOH+H2O2)作用下發(fā)光。 b.環(huán)1，2-二氧乙烷衍生物 為磷酸脂酶設(shè)計的底物，含金剛烷基，在堿性磷酸酶作用下脫去磷酸根形成中間體，中間體自發(fā)性斷裂的同時發(fā)出光子。,電化學發(fā)光免疫分析 標記物為三聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+),當用磁性微珠鏈接并吸附到電極表面誘使電化學發(fā)光而作為檢測信號的免疫分析法。主要特點，在氧化劑TPA不斷的到補充時，發(fā)光可周而復始進行。,ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖,3)時間分辨熒光免疫分析（tim

22、e resolved fluorescence,TRF) 以鱉合三價鑭系元素銪（Eu)、鋱（Tb)、鏑（Dy)、釤（Sm)為標記物標記抗原（抗體），利用其熒光延遲發(fā)射的特性，以與短壽命背景熒光時間相區(qū)分的性質(zhì)進行檢測的免疫分析方法。 分析光譜學性質(zhì) 1) 激發(fā)光譜帶較寬（300-500nm),有利于增強激發(fā)，提高信號強度； 2）發(fā)射譜帶較窄(10nm),有利于排除干擾；,3)Stoke位移較大（250-300nm),有利于與激發(fā)光相區(qū)分； 4）熒光壽命較長（60-900S),Eu3+為714 S,而一般生色團1-100 S，蛋白質(zhì)1-10 S，所以延遲測量可消除背靜干擾； 5）標記穩(wěn)定，可保存

23、1-2年。,波長,300 400 500 600 700,Stakes,吸光度,Stakes 位移示意圖,激發(fā)光,熒光,光強度,激發(fā),短壽命熒光,長壽命熒光,延遲時間,測量時間,銪螯合物的激發(fā)、發(fā)射光譜,LUMINO準自動化學發(fā)光免疫分析儀器,中國與國際免疫診斷現(xiàn)狀,4）各種體外分析法的比較,化學發(fā)光與酶免的對比表,化學發(fā)光與放免的對比表,化學發(fā)光與時間分辨熒光的對比：,5.3中子活化分析(neutron activation analysis ,NAA) 1.分析原理 原理 利用中子核反應將待測核素轉(zhuǎn)變成放射性核素，而進行放射性分析的一種核素分析方法。按中子能量不同，可分為熱中子或快中子活化

24、兩類。熱中子一般利用（n,r）反應激活樣品，其熱中子俘獲截面大.快中子利用（n,p）,(n,)反應激活樣品。,穩(wěn)定核素 放射性核素 穩(wěn)定核素 即穩(wěn)定核素經(jīng)中子俘獲核反應，被活化轉(zhuǎn)變成放射性核素。 如,基于中子活化技術(shù)的煤炭全元素在線分析系統(tǒng)的研究,基于中子活化技術(shù)的煤炭全元素在線分析系統(tǒng),步驟 活化分四個步驟，除樣品制備外，其余分三個為： 輻照 選擇對待測反應截面大，且干擾反應小的一定能量和通量的中子照射樣品，使待測核素部分轉(zhuǎn)變成為放射核素。 冷卻 在停止照射到測量過程，讓樣品等待的一段時間t2,目的是讓一些短壽命干擾核素衰變掉，或?qū)Ρ徽丈錁悠纷霰匾姆呕蛛x。,測量和數(shù)據(jù)分析 通過對活化核素

25、放出射線能量和強度的測量，對待測樣品進行定性和定量分析。 待測核素活化后的射線強度在簡單情況下為,其中，W待測核素的重量；Na阿伏加德勒常數(shù)；中子對該核素的活化截面，是能量的函數(shù)；探測裝置對某種射線的探效率；活化核的衰變常數(shù),t1-照射時間，t2-冷卻時間。,計量,由上式可知，在相關(guān)參數(shù)確定后，根據(jù)射線的能量，可定性核素，根據(jù)射線強度的測量可由上式求得含量，這種方法稱為絕對測量，為了避免相關(guān)參量測量的繁雜和不確定性，常采取相對測量。 相對測量 待測樣品和該元素含量已知的標準在相同條件下活化和測量，此時： 式中，x-待測樣品，s-標準。,特點 非破壞性、多元素（周期表幾乎所有元素）同時分析,靈敏

26、度高（10-6-10-10）,準確度高（1%）。,2.活化分析的干擾反應 此處的干擾是指活化過程本身可能產(chǎn)生的干擾反應。 1)樣品中不同元素可能通過不同核反應產(chǎn)生同一種被鑒定的核素，如,這類干擾無法在探測中排除，但通過選擇中子能量或活化前作必要分離，可盡量減少干擾。在熱中子活化時，因,(n,p)反應截面遠小于（n,r）的,問題并不嚴重，但在快中子活化時，應考慮是否存在干擾。 2）其它核素被活化產(chǎn)生能量相近的射線，這種干擾可利用核素的半衰期不同，選擇適合冷卻時間，或采用高分辨率探測器將它們區(qū)分開來。,3.分析設(shè)備和輻照條件選擇 活化的設(shè)備主要有，輻照中子源，樣品傳送及放化分離設(shè)備，射線探測和分析

27、設(shè)備。 輻照源有：反應堆、同位素中子源（如，Ra-Be）、裂變中子源（中子管）和加速器。同位素中子源體積小，便于攜帶；反應堆中子通量最大，尤其是高通量的熱中子，其反應截面大，分析靈敏度高，可供分析元素多。中子管主要用于野外作業(yè)。,樣品輻照條件 選擇反截面大，干擾反應小的中子反應類型，以生成放射性核素的半衰期和射線能量適合的核素，輻照時間一般為放射性核素的2-3個半衰期，中子通量視反應截面和元素含量而定，樣品一般采用氣動傳送管道送到輻照部位，再由輻照部位傳到測量部位，探測信號通過電纜送到分析儀上。這樣既可避免高劑量對人的危害，又可進行短半衰期核素的測量?，F(xiàn)在探測器多為高分辨的Ge（Li） 探測器

28、。,4.測量和數(shù)據(jù)分析 活化后的放射性測量 半衰期和能譜測量 1)衰變曲線法 對于短壽命的放射性核素，可由衰變曲線的測定進行定量分析。只有一種核素的簡單情況下，照射結(jié)束時的射線的強度，與不同測量時刻的強度為一指數(shù)關(guān)系。,如果活化后生成兩種以上的放射性核素，在任意時刻測得的放射性強度是各種放射線強度之和。即 用最小二乘法擬合或用剝譜法將混合衰變曲線分解，以得到各個單個組分的衰變曲線。,2）能譜法 測定活化樣品的能譜，確定某一特征峰下的總計數(shù)，則刻度轉(zhuǎn)換矩陣可求得相應核素的含量。該方法可進行多元素同時分析，準確度較高，但因探測效率限制，靈敏度受到有影響。 3）特征射線壽命法 為以上兩種方法的結(jié)合。

29、即選一特征能量峰，測量衰變曲線。,5.樣品制備 一般只需原始形態(tài)的樣品，無需分離純化。因為中子活化靈敏度很高，在準備樣品時要特別注意對樣品可能污染。 植物樣品 選取樣本，洗凈表面，盛聚乙稀小袋，在干燥箱干燥，用不銹鋼刀切取試樣，稱量50-100mg, 用包藥紙包上，封入聚乙稀小袋，裝入石英盒，輻照。 植物標準樣品 將已知量的分析成分配成所需濃度，滴加在直徑2cm的濾紙，裝入聚乙稀袋。,動物樣品 毛發(fā)等固態(tài)樣品，用稀硝酸、蒸餾水洗凈，風干；半固態(tài)臟器，冷凍干燥；液態(tài)樣品，滲透在濾紙上干燥,取100-300mg裝入尼龍小袋。 土壤樣品 風干、過2mm篩，取100mg裝入聚乙稀袋，輻照。,6.應用,

30、環(huán)境學中的應用 1）環(huán)境微量元素背景值研究 研究意義 未受或極少到受人類活動影響的自然環(huán)境、水域、土壤和大氣中固有的物質(zhì)組成和各種化學元素的自然含量水平，稱為背景值。背景值研究是環(huán)境科學的一項基礎(chǔ)性工作，它可為環(huán)境監(jiān)測與評價以及污染預測與防治提的科學決策提供依據(jù)。,實驗方法及特點 a.水環(huán)境樣品 貯存 水樣中的元素背景含量極低，用容器存放過程，要防止被污染或微量金屬離子被器壁吸附，因此常用HNO3酸化至PH=1-2,進行貯存。 濃集 冷凍干燥，殘渣用作中子活化，優(yōu)點是減少了操作中環(huán)境對樣品污染的可能，同時無試劑空白的影響；低溫蒸發(fā)，使100ml水濃縮至1 ml, 轉(zhuǎn)移到聚乙稀薄膜上，烘干作中子

31、活化。該方法制樣簡便快速。,照射與測量 樣品和標準封裝于同一容器，經(jīng)一定時間照射和衰變，轉(zhuǎn)移至聚乙稀測量瓶測量。 質(zhì)量控制 空白實驗表明樣品預濃縮不會引起顯著污染；靈敏度 對稀有和稀土元素 ，方法高于其它方法；精密度 1%；準確度 與標準參考物在10%范圍一致。,b.土壤樣品 采取有代表性未污染樣品、風干剔除殘根和瓦礫、粉碎、研磨過100篩，在干燥器中保存，稱量50mg左右，用高純鋁箔包裹、照射。標準制備，準確吸取標樣滴加在6mm濾紙片，自然干燥，用鋁箔包裹、照射。準確度和精密均在好于10%。 c.氣體樣品 用抽濾法收集氣溶膠，過濾前后在恒溫條件稱量濾膜的干重，然后照射、測量。,2)大氣污染來

32、源及貢獻 氣溶膠化學元素的組成及其濃度 由元素濃度的粒經(jīng)分布，富集特征說明氣溶膠不同組分的來源，人為活動對大氣的干擾。 污染源對環(huán)境的負荷及貢獻率 以大氣為例，20世紀70年代前，常采用擴散模型進行研究。因需要的污染物排放參數(shù)，氣象參數(shù)及氣溶膠的動力學參數(shù)難以準確得到，70年代后，開始采用受體模型。受體模型假設(shè)樣品氣溶膠的化學組分是所有污染源按負荷權(quán)重的線性迭加結(jié)果。,有關(guān)關(guān)系如下： 設(shè)樣品的氣溶膠質(zhì)量為各污染排放源的貢獻和，即 設(shè)排放源排放元素的重量濃度為 ， 為第j個排放源排出i元素的量。,設(shè) ，表示排放源的貢獻率，且考 慮到誤差因素，則樣品中某元素的濃度為： 以上為一多元線性方程，方程的

33、系數(shù) ，可通過對各排放源的分析得到，因此 可用最小二乘法確定。,生命科學研究中的應用 1）微量元素與疾病的關(guān)系 微量元素參加生物的各種代謝活動, 其缺乏或過多，均會引起代謝失調(diào)，甚至并發(fā)多種疾病。中子活化因具有靈敏度高，準確度良好，多元素分析，無試劑空白，非破壞分析的優(yōu)點，常用于微量元素與疾病關(guān)系的研究。,2）元素賦存狀態(tài)的分析 元素的化合態(tài)和賦存狀態(tài)，如在細胞或亞細胞中的分布，在各種酶、核酸、糖等大分子的含量， 決定著其生物學特性。把中子活化與化學或生化分離方法相結(jié)合，進行素賦存狀態(tài)分析是中子活化分在生科學研究應用的一個重要方面。 3）在公共衛(wèi)生 研究地方病起用因，環(huán)境有害元素對建康危害的調(diào)

34、查。,例 同步輻射熒光研究肝細胞癌組織和癌旁組織微粒體內(nèi)的金屬蛋白分布 目的：研究肝癌組織和癌旁組織的微粒體中金屬蛋白的分布特征的差異，以尋找肝癌的指示微量元素及賦存形式。 方法：用差速離心法提取肝癌組織和癌旁組織的微粒體組分，用等電聚焦分離微粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)，用同步輻射X 熒光（SRXRF）測定各蛋白條帶內(nèi)微量元素的含量得到金屬蛋白分布信息。 結(jié)果：癌組織的等電點（pI）為5.9 的含鐵條帶中鐵含量僅為癌旁組織相應條帶的40%，在pI 為9.3 的條帶中銅、鋅的含量分別是癌旁組織的2 倍和3.5 倍。 參見：董元興等.核技術(shù)，2006,29（9）：641-645,活化示蹤 用稀有穩(wěn)定核素作為示

35、蹤劑示蹤,然后用中子活化法對樣品進行分析, 既避免了放射性核素示蹤過程核輻射對人及環(huán)境的不利影響，又充分利用了放射測量靈敏的特點。,元素的溯源性分析,在微量元素分析中, 常需標準物進行測量比對, 中子活化被認為是對標準物定值最準確最精密的方法。 -中子活化, - 原子吸收, -熒光 , -發(fā)射 -質(zhì)譜,5.4 稀釋質(zhì)譜分析(IDMS) 1. 原理 稀釋質(zhì)譜分析是在樣品中定量加入富含待測元素稀有同位素核素的內(nèi)標，使其與樣品充分混合，通過質(zhì)譜法測定樣品中元素的同位素豐度及其改變，以達到定量待測元素含量的方法。為了消去其它因子的影響, 該法一般選擇待測元素的一對稀有同位素核素同時進行豐度測定, 并用

36、其比率進行相關(guān)計算。,公式推導 設(shè)： 為樣品或內(nèi)標中某待測元素的原子個數(shù)；下角標 分別表示樣品或內(nèi)標; 分別為樣品、內(nèi)標和混合樣中元素的同位素豐度，下角標 表示所選的一對同位素核素。則對待測同位素對有關(guān)系:,（1） （2） ： （3） （4）,（5） （6） （7） （8）,2.特點 1)為絕對測量法 2)無需對待測元素定量分離,也不需對分離效率進行校正， 內(nèi)標與樣品混合均勻后, 同位素豐度比在分離過程中保持恒定, 分離不會影響定量。 3)精確度和準確度高 將化學測定轉(zhuǎn)換為同位素豐度測定，由于質(zhì)譜選擇性的篩選作用消除其它干擾離子，且比率的測定能夠消除其它因子的干擾，因此測量精度高。定量準確性由

37、所加入內(nèi)標的準確性決定，一般用容重法確定，因此準確度高。 4)適應元素范圍寬 具有多同位素的元素都可用此法。 5)靈敏度 10-9-10-12g,3. IDMS 在環(huán)境樣品分析中的應用 水 水是最重要的環(huán)境介質(zhì)，水中微量元素的含量會直接影響人體健康。 沉積物 近年來海(河) 底沉積物在環(huán)境樣品的測試中占有很大的比重。 參考文獻： 周霄等.同位素稀釋質(zhì)譜法測量環(huán)境樣品中的微量元素.質(zhì)譜學報,2001,22(4):1-10,5.4 參數(shù)文獻 1.同位素稀釋電感耦合等離子體質(zhì)譜測量植物與人發(fā)標準物質(zhì)中鉛. 高等學校化學學報, 2002, 23(9):1689-1691. 2.同位素稀釋質(zhì)譜法測量環(huán)境

38、樣品中的微量元素. 質(zhì)譜學報 ,2001,22(4):1-17 3.同位素稀釋質(zhì)譜法測量水樣品中的痕量鎘和鉛. 環(huán)境化學,2000,19(4):369372 4.同位素稀釋質(zhì)譜法測量大米中微量鎘的研究, 質(zhì)譜學報, 20(4) 12913 5.同位素稀釋質(zhì)譜在化學計量學中的應用. 質(zhì)譜學報19(2), 1621,5.4 參數(shù)文獻 6 同位素稀釋質(zhì)譜測定微量鐵的國際合作研究. 質(zhì)譜學報,12(3)1-5 7 同位素稀釋質(zhì)譜測定人尿中微量鎳、銅、鉛. 核化學與放射化學，1917（1）:3842。 8 鋅同位素比值和含量的雙稀釋質(zhì)譜測量法.核化學與放射化學，1994，16（3）:142150 9 同

39、位素稀釋質(zhì)譜法用于河水鉀的測量溯源性研究.質(zhì)譜學報2002，23（1）:7-10,5.4分類檢索條件構(gòu)造 (isotope dilution mass spectrometry ) and (heavy metal) (isotope dilution mass spectrometry ) and (Pb) (isotope dilution mass spectrometry ) and (Cd) (isotope dilution mass spectrometry) and (Cr) (isotope dilution mass spectrometry) and (Hg) (isot

40、ope dilution mass spectrometry) and (Cu) (isotope dilution mass spectrometry) and (Zn),5.4分類檢索條件構(gòu)造 (isotope dilution mass spectrometry) and (Se) (isotope dilution mass spectrometry) and (As) (isotope dilution mass spectrometry) and (Mo) (isotope dilution mass) and (creatinine) (isotope dilution mass spectrometry) and (cholesterol) (isotope dilution mass spectrometry) and (vitamin) (isotope dilution mass) and (indolebutyric acid),4.5分類檢索條件構(gòu)造 (isotope dilution mass spectrometry) and (folates) (isotope dilution mass spectrometry) and (methoxypyra