1、3.2.1 雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的理論 3.2.2 雜交瘤技術(shù)過程 3.2.3 單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn) 3.2.4 單克隆抗體的改造和應(yīng)用,3.2 單克隆抗體技術(shù),免疫系統(tǒng),由淋巴器官、組織、細(xì)胞共同構(gòu)成。 免疫器官： 中樞免疫器官：骨髓、胸腺、（鳥、禽）法氏囊 外周免疫器官：淋巴結(jié)、脾、扁桃體等 免疫細(xì)胞： 造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞（T、B、NK）、白細(xì)胞等。 免疫分子： 抗體、補體、細(xì)胞因子、干擾素等。,3.2 單克隆抗體技術(shù),胸腺,骨髓,中樞淋巴器官,外周淋巴器官,扁桃體，淋巴結(jié),淋巴結(jié),脾,淋巴管,腸系膜淋巴結(jié),T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化,3.2 單克隆抗體技術(shù),T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,一、抗原的

2、識別與遞呈（感應(yīng)階段）,二、反應(yīng)階段,三、效應(yīng)階段,四、細(xì)胞免疫的生物學(xué)效應(yīng),3.2 單克隆抗體技術(shù),一、抗原的識別與遞呈（感應(yīng)階段）,（一）APC對抗原的遞呈 （二）T細(xì)胞的雙識別,3.2 單克隆抗體技術(shù),抗原呈遞細(xì)胞 (antigen-presenting cell ),一種特殊類型的細(xì)胞，攜帶細(xì)胞表面MHC（主要組織相容性復(fù)合體）II類分子，涉及抗原的加工和呈遞給輔助T細(xì)胞。,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2 單克隆抗體技術(shù),T細(xì)胞活化的第一信號,二、反應(yīng)階段,由TCR 識別并結(jié)合抗原性多肽傳遞抗原信號；CD4、CD8分子分別識別MHC-II類和MHC-I類分子。,3.2 單克隆抗體技術(shù),

3、T細(xì)胞活化的第二信號,又稱協(xié)同刺激信號，由眾多協(xié)同刺激分子與相應(yīng)受/配體結(jié)合介導(dǎo)，主要是B7/CD28分子對之間的作用。,3.2 單克隆抗體技術(shù),T細(xì)胞在雙信號的激發(fā)下，表達細(xì)胞因子及相應(yīng)受體，進一步促進T細(xì)胞活化、增殖。 若TCR特異性識別并結(jié)合抗原肽的過程中缺乏協(xié)同刺激信號，則T細(xì)胞被誘導(dǎo)呈不應(yīng)答。,3.2 單克隆抗體技術(shù),（三）T細(xì)胞的增殖和分化,CD4+ TH 分化為： TH1 CD8+ CTL（TC )分化為： 有殺傷效應(yīng)的CTL （TC ),3.2 單克隆抗體技術(shù),Tc殺傷細(xì)胞,3.2 單克隆抗體技術(shù),細(xì)胞免疫應(yīng)答,3.2 單克隆抗體技術(shù),體液免疫應(yīng)答,3.2 單克隆抗體技術(shù),抗原

4、：一類能夠刺激動物機體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)發(fā)生免疫 應(yīng)答，產(chǎn)生體液免疫的抗體和（或）細(xì)胞免疫的效 應(yīng)淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與之反應(yīng)的物質(zhì)。,3.2 單克隆抗體技術(shù),能起抗原作用的各類物質(zhì)必須具備如下特性：,(1)外源性 機體以往從未接觸過的外源異物或異體； (2)結(jié)構(gòu)性 分子量在10，000以上的大小，分子表面有穩(wěn)定 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團(而非線狀基團)作為識別位點； (3)特異性 由于抗原有不同的決定簇，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體與 抗原間的反應(yīng)是特異性的。,3.2 單克隆抗體技術(shù),抗體：在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一 類糖蛋白,能與相應(yīng)抗原特異的結(jié)合，產(chǎn)生各種 免疫效應(yīng)（生理效應(yīng)）的球蛋白。,3.2

5、 單克隆抗體技術(shù),抗體 (Ig) : （Immunoglobulin) 抗體分類： IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE,抗體結(jié)構(gòu),3.2 單克隆抗體技術(shù),抗體作用的機理,中和反應(yīng) 聚集反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 補體活化,3.2 單克隆抗體技術(shù),每個B淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種針對它能夠識別的特異性抗原決定簇的抗體，而由這一個細(xì)胞通過有絲分裂繁殖形成的細(xì)胞群稱為“克隆”，由這一個克隆系產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2.1單克隆抗體技術(shù)的基本理論,正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是Koh

6、ler和Milstein 于1975年將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。,3.2 單克隆抗體技術(shù),Georges J. F. Kohler,Csar Milstein,3.2 單克隆抗體技術(shù),單克隆抗體 (monoclonal antibody),隨著在研究上應(yīng)用日益廣泛，對抗體的數(shù)量和質(zhì)量 （專一性）要求越來越高 數(shù)量多: 傳統(tǒng)的實驗動物馬,兔等免疫不方便 質(zhì)量高: 大動物免疫難以做到單克隆,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2 單克隆抗體技術(shù),單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù) (雜交瘤技術(shù)),用細(xì)胞融合技術(shù)獲得單克隆抗體綜合了兩方面優(yōu)勢： 淋巴細(xì)胞腫瘤: 能不斷增殖，沒有產(chǎn)生專一抗體

7、能力。 從脾臟得到淋巴細(xì)胞: 能產(chǎn)生專一抗體，不能不斷增殖。,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2.1.1雜交瘤技術(shù)的基本原理,利用細(xì)胞融合技術(shù)，將已免疫過的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，在由此形成的單個雜種細(xì)胞中，B細(xì)胞提供產(chǎn)生單一型抗體的遺傳信息，瘤細(xì)胞提供連續(xù)增殖的遺傳信息。 因此這種雜種細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能無限繁殖。,3.2 單克隆抗體技術(shù),高度均一性： 純度很高的均一性抗體 高度專一性： 只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應(yīng) 大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性： 雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無限繁殖之傳代,3.2.1.2 單克隆抗體的特性,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2.1.3 親本細(xì)胞的選擇,骨髓瘤細(xì)胞： 1.本身不能分

8、泌抗體 2.選擇次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤細(xì)胞,3.2 單克隆抗體技術(shù),B淋巴細(xì)胞： 1.經(jīng)特定抗原免疫能產(chǎn)生目的抗體的動物淋巴細(xì)胞 2.免疫動物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近親源關(guān)系,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2.1.4 融合細(xì)胞的選擇原理,1964年Litterlefield HAT培養(yǎng)基 HHypoanthine 次黃嘌呤 AAminopterin 氨基喋呤 TThymidine 胸腺嘧啶脫氧核苷,3.2 單克隆抗體技術(shù),原理：,正常及普通癌細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷氨酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力，而且當(dāng)這條

9、主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此應(yīng)急通路來合成DNA的能力。,3.2 單克隆抗體技術(shù),細(xì)胞內(nèi)DNA的生物合成途徑,主要生物合成途徑,應(yīng)急通路,氨基喋呤A,次黃嘌呤,次黃嘌呤核苷酸,HGPRT+,TK+,胸腺嘧啶,胸腺嘧啶 脫氧核苷酸,DNA,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2.2 雜交瘤技術(shù)過程,免疫動物 融合細(xì)胞的制備 兩種細(xì)胞雜交融合 分裝培養(yǎng) 抗體檢測 雜交瘤細(xì)胞的克隆 凍存及單克隆的大量生產(chǎn),3.2 單克隆抗體技術(shù),雜交瘤技術(shù)操作流程圖解,一、免疫動物,目的： 在細(xì)胞融合

10、后獲得盡可能多的分泌針對于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.,特定目標(biāo)抗原,動物,免疫,脾臟中B淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞大量增殖,刺激,能分泌針對于該抗原的特異性抗體,3.2 單克隆抗體技術(shù),常規(guī)免疫法 脾內(nèi)一次性免疫法 短程免疫法 體外免疫法,常用免疫方法：,穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆,省時；省抗原,省時,操作繁瑣,3.2 單克隆抗體技術(shù),腹腔注射,靜脈注射,皮下注射,免疫途徑：,3.2 單克隆抗體技術(shù),常規(guī)免疫法：,第1次免疫：抗原+弗氏完全佐劑,(皮下注射或靜脈注射),(皮下注射),(皮下注射),(靜脈注射),3.2 單克隆抗體技術(shù),二.融合細(xì)胞的制備,脾淋巴細(xì)胞的制備： 1.放血致死免疫的小鼠，無菌

11、操作取脾臟，去胞膜； 2.用RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)液清洗后，放在盛10ml培養(yǎng)液的 平皿的雙層銅網(wǎng)上； 3.用注射器內(nèi)玻璃管將脾淋巴細(xì)胞輕輕擠壓到培養(yǎng)液中； 4.計數(shù)后將細(xì)胞液裝入加蓋離心管置冰箱備用,3.2 單克隆抗體技術(shù),骨髓瘤細(xì)胞的制備,1.主要源于P3-Nsl-Ag4等骨髓瘤細(xì)胞系 2.選擇形態(tài)好的骨髓瘤細(xì)胞，0.2%臺盼藍染液，計數(shù) 3.1500rpm離心，棄上清液，加培養(yǎng)液清洗后再次離心 注：在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。 保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)， 活細(xì)胞計數(shù)高于95%，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵,3.2 單克隆抗體技術(shù),三.兩種細(xì)胞雜交融合,1

12、.按4:1-10:1的比例將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混勻于同一個離心管中； 2.離心，棄上清液. 3.置于是37水浴中，搖動離心管逐滴加入1ml pH7.2-7.6的50%PEG，1分鐘內(nèi)完成，水浴中繼續(xù)搖動1-2分鐘； 4.沿管壁加入10ml培養(yǎng)液，混勻稀釋 PEG，終止其誘導(dǎo)作用；1000rpm 迅速離心1分鐘，棄上清液。,3.2 單克隆抗體技術(shù),四.分裝培養(yǎng),1.離心后的混合細(xì)胞中加入HAT培養(yǎng)液，使?jié)舛冗_到2*105個 細(xì)胞/0.1ml培養(yǎng)液 2.按每孔0.1ml細(xì)胞稀釋液加入96孔培養(yǎng)板中，加蓋密封后置 5%CO2培養(yǎng)箱37培養(yǎng) 3.次日檢查有無污染，若正常，換液（HAT培養(yǎng)液），以后隔

13、日一換 4.兩周后改用HT培養(yǎng)液，換3-5次后改用D-15培養(yǎng)液培養(yǎng)未融 合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞5-6天后逐漸死亡,3.2 單克隆抗體技術(shù),融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況 脾細(xì)胞（ HGPRT+, TK+, 不能長期生長） 骨髓瘤細(xì)胞（ HGPRT-, TK-，不能生長 ） 雜交瘤細(xì)胞（ HGPRT+, TK+ ，能夠生長）,3.2 單克隆抗體技術(shù),篩選： 免疫熒光 ELISA等,五.雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化,3.2 單克隆抗體技術(shù),克隆化： 有限稀釋法 軟瓊脂培養(yǎng)法,3.2 單克隆抗體技術(shù),抗體檢測,抗原結(jié)合法 用125I放射性元素標(biāo)記的抗原 第二抗體法 -酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA

14、） 熒光活化細(xì)胞分類器法,3.2 單克隆抗體技術(shù),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液,技術(shù)原理：,3.2 單克隆抗體技術(shù),單克隆抗體的純化 硫酸銨沉淀法 離子交換層析 A蛋白-Sepharose親和層析,3.2 單克隆抗體技術(shù),單克隆抗體的生產(chǎn) 體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水 體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等,3.2 單克隆抗體技術(shù),3.2.3單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn),雜交瘤細(xì)胞直接植入動物體內(nèi)： 1.將106-107的單克隆雜交瘤細(xì)胞，由皮下植入同系或組織相容正常的小鼠的體內(nèi)，約過兩周后，在小鼠的皮下形成相應(yīng)的移植性腫瘤，用這些腫瘤再去接種更多的小鼠。 2.在腫瘤出現(xiàn)

15、后的一段時期，通過多次采血得到含單克隆抗體的血清，每ml血清內(nèi)約含1-10ml的抗體，但取血量有限。 3.因此，可將相同數(shù)量的單克隆抗體細(xì)胞植入在3-10天前經(jīng)腹腔注射0.5ml異十八烷或其它礦物油的初次致敏的小鼠腹腔內(nèi)。在接種后的二周左右的時間內(nèi)，經(jīng)穿刺而得到5-10ml的腹水，內(nèi)含單克隆抗體的濃度5-20mg/ml,3.2 單克隆抗體技術(shù),現(xiàn)在的生物技術(shù)公司一般采用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的方法生產(chǎn)單克隆抗體。由于雜交瘤細(xì)胞的高密度生長，使得抗體效價可達到10100mg/ml。 美國Damon公司的專利方法是將細(xì)胞培養(yǎng)在一種中空的微球體內(nèi)，這種被稱之為微囊的微球體外面由多孔膜包裹，使內(nèi)部生長的雜交瘤細(xì)胞受到多層保護而不受環(huán)境影響。此種微囊技術(shù)生產(chǎn)的抗體可達0.1-1g/L?？贵w的生產(chǎn)達到一定的規(guī)模。,3.2 單克