1、,病毒學（Virology）,病毒學是研究病毒這一特殊生命形式的性質(zhì)及其與宿主相互作用的關系的自然學科，是跨生物學、醫(yī)學、農(nóng)學的交叉學科，是分子生物學研究領域的前沿學科。,第一章 緒論,第一節(jié) 病毒學研究的對象與任務 一、病毒學研究的對象 病毒（Virus）是一種特殊的生命形式，是一種極為簡單的生命形式。,（一）病毒的特點,1、病毒結構簡單 (1)不具有細胞結構 (2)只具有一種核酸（DNA或RNA） (3)不含核糖體和完整的酶系統(tǒng)，也不具有能量合成和代謝系統(tǒng)。 2、獨特的繁殖方式 (1)不具有雙分裂 (2)以復制方式進行繁殖 3、絕對的細胞內(nèi)寄生,4、病毒的二重性,(1)病毒存在形式的二重性

2、 *細胞外具有感染性的顆粒形式 *細胞內(nèi)具有繁殖性的基因形式 (2)病毒結構形式的二重性 *完全病毒與缺損病毒（defect virus） *病毒與假型病毒(pseudo type virus)、假毒粒(pseudovirion) *病毒顆粒與空殼 (3)病毒來源的二重性 * 外源性病毒 從細胞外到細胞內(nèi)在細胞間水平傳播的病毒 * 內(nèi)源性病毒 在宿主發(fā)育早期感染宿主，病毒基因組整合于宿主基因組并與其同步復制，隨細胞分裂垂直傳遞給子代細胞，但因其受宿主細胞控制，病毒基因組只能部分表達，故沒有子代病毒產(chǎn)生，且對宿主一般不造成傷害。,（二）病毒的定義,病毒是占據(jù)一定生境，并具有獨立于其宿主進化史的絕

3、對細胞內(nèi)寄生物，其基因組（DNA或RNA）被其自身編碼的蛋白質(zhì)外殼所包圍。,(三）、病毒的宿主范圍,宿主范圍：病毒所能感染的宿主和宿主細胞的種類 按宿主種類劃分,Euvirus Virus Subvirus Viroid Satellite agent Satellite RNA Satellite virus Prion,蟲媒病毒（arbovirus） 以蚊、蜱、螨、白蛉等節(jié)肢動物為媒介，在脊椎動物中廣泛傳播的病毒。,（四）、病毒的起源,三種假說： 病毒起源于細胞的DNA/RNA 病毒的退行性進化假說 病毒起源于具有復制能力的寡聚核苷酸,四、病毒學研究任務,理論方面：推進現(xiàn)代生物學的發(fā)展 應

4、用方面： 控制和消滅危害人類健康和社會發(fā)展的病毒危害 利用病毒對有害生物進行生物防治 促進生物高新技術的發(fā)展,第二章 病毒學研究的基本方法,一、病毒的分離,（一）標本的采集與處理 （二）標本的接種： 實驗宿主（動物、植物或細菌）， 雞胚或細胞培養(yǎng) （三）病毒存在的認定 1、系統(tǒng)癥狀,2、局部反應 (1)噬菌體噬菌斑(plaque) 噬菌體感染生長在營養(yǎng)瓊脂平板上的細菌所形成的，具有一定大小和形狀的透明區(qū)域。 (2)動物病毒蝕斑或稱空斑(plaque) 動物病毒感染單層細胞培養(yǎng)所形成的局部病損區(qū)域，系由病毒的致細胞病變作用所引起,致細胞病變作用（Cytopathic effect ， CPE）

5、： 病毒感染細胞培養(yǎng)引起的細胞顯微表現(xiàn)的改變，如細胞聚集成團，腫大、園縮、脫落、細胞融合形成多核細胞、細胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體（inclusion body），乃至細胞裂解等 （）植物病毒壞死斑或稱枯斑（necrosis spot） 植物病毒感染敏感植物葉片所形成的局部病損區(qū)域,（四）盲傳（blind passage） 將取自經(jīng)接種而末出現(xiàn)感染癥狀的宿主或細胞培養(yǎng)的材料，再接種于新的宿主或細胞培養(yǎng)，以提高病毒的毒力或效價,二、病毒的純化,(一)病毒的純化 1.病毒純化的標準 (1)純化的病毒制備物應保持感染性 (2)純化的病毒制備物應具有均一性 病毒制備物均一性檢查的方法 包括：電鏡檢查、超速離心、電

6、泳和免疫學方法,（二）病毒純化的方法,1,病毒純化方法的依據(jù) (1)病毒顆粒具有一定的大小和密度，在離 心場中能以一定的沉降速率沉降 (2)病毒顆粒的主要化學組成為蛋白質(zhì) 2.病毒純化的方法 包括:超速離心,沉淀法,凝集技術,液態(tài)兩相分配系統(tǒng),有機溶劑萃取,層析和電泳等,三、病毒的測定（assay of vrvuses）,病毒的測定即病毒的定量分析 (一) 病毒的物理顆粒計數(shù) 1. 電鏡計數(shù)，將待測病毒樣品與已知數(shù)目的聚苯乙烯乳膠顆粒均勻混合后置電鏡觀察，統(tǒng)計病毒顆粒數(shù)目與乳膠顆粒數(shù)目，根據(jù)兩類顆粒數(shù)目之比即可計算出待測樣品中的病毒顆粒數(shù)目。,2.血細胞凝集試驗 血細胞凝集作用（Hemaggl

7、ution） 許多動物病毒的包膜蛋白或外殼蛋白在一定條件下（溫度、pH、離子濃度等）能引起體外的一定種類的脊椎動物紅血球細胞凝集，此即血細胞凝集作用。 血細胞凝集試驗 由于具有血凝性質(zhì)的病毒所能凝集血細胞的量與病毒濃度成正比，根據(jù)這一原理設計的血細胞凝集試驗即可用于病毒定量測定。,待測病毒樣品 2倍稀釋,1:1,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560,每孔分別加入等體積一定濃度的紅球血細胞,置室溫孵育一定時間,觀察結果并計算病毒血凝效價,（二）病毒的感染性測定（assay of viral infectivity）,*感染性測定測

8、定因感染所引起宿主或細胞培養(yǎng)某一特異性感染反應的病毒數(shù)量。 *感染單位（infectious units, IU）:引起宿 主或宿主細胞培養(yǎng)一定特異性反應的病毒最小劑量 *效價（title）：單位體積（ml）病毒原液所含的病毒感染單位的數(shù)目（I/ml）。,1、 噬（蝕）斑測定 （1）噬菌體的噬菌斑測定，瓊脂疊層法（agar layer method） 一定量的經(jīng)系列稀釋的噬菌體懸液分別與高濃度的敏感細菌，以及半固體營養(yǎng)瓊脂均勻混合后，塗布在已鋪有較高濃度營養(yǎng)瓊脂的平板上，經(jīng)過孵育培養(yǎng)，在延伸成片的細菌菌苔上出現(xiàn)分散的單個噬菌斑。根據(jù)病毒的一次擊中（one-hit）動力學性質(zhì)，一個有感染性的病毒

9、即可引起一個細胞的感染并形成一個噬斑，并且其數(shù)目與樣品中有感染性的噬菌體顆粒數(shù)量成正比，故統(tǒng)計噬斑數(shù)目后即可計算出噬菌體懸液效價，并以噬斑形成單位（plague forming units ， PFU）/毫升（ml）表示。,、動物病毒的蝕斑測定 空斑測定 轉化測定 合胞體計數(shù) 、植物病毒的環(huán)死斑測定 半葉法,、終點法（end point method） 取等體積的經(jīng)倍比稀釋的病毒系列稀釋液分別接種大量同樣的試驗單元（如實驗動物、雞胚或細胞培養(yǎng)），經(jīng)過一段時間孵育后，以試驗單元群體的半數(shù)（50%）個體出現(xiàn)某一感染反應的病毒劑量，來確定病毒樣品的效價，稱做半數(shù)效應劑量，并以50試驗單元出現(xiàn)感染反應

10、的病毒稀釋度的倒數(shù)的對數(shù)值表示。 根據(jù)試驗單元及感染反應的性質(zhì)分為： 半數(shù)致死劑量（50% lethal dose, LD50） 半數(shù)感染劑量（50% infective dose, ID50） 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose, TCID50）,終點測定實驗記錄舉例,根據(jù)Reed和Muench方法 半數(shù)效應劑量(LD50, ID50或TC ID50) =50%感染率的高臨界稀釋度倒數(shù)的對數(shù)距離比稀釋系數(shù)的對數(shù) 上式中： 距離比 在上例中，距離比71-50/71-13=0.36 稀釋系數(shù)為10 故LD50=log1/10-3+0.36Xl

11、og10=3.36 即該待測樣品的LD50效價是10-3.36,四、病毒的鑒定,（一）根據(jù)病毒感染宿主的范圍及感染表現(xiàn)的鑒定 1、病毒感染的宿主范圍 宿主譜 2、病毒感染的癥狀表現(xiàn) 感染宿主機體疾病癥狀 感染雞胚在雞胚絨毛尿囊膜上形成痘皰（pock）的形態(tài)。 感染細胞培養(yǎng)致細胞病變效應表現(xiàn) 3、病毒的傳播途徑與傳播媒介,（二）病毒的理化性質(zhì)鑒定 1、電鏡技術 2、分析超速離心技術 (三)病毒對理化因子敏感性的鑒定 （1）病毒對DNA合成抑制劑的敏感性試驗 （2）脂溶劑敏感試驗 （3）耐酸性試驗 (4) 溫度敏感試驗 (5) 紫外敏感試驗,(四)紅細胞凝集性質(zhì)的鑒定 不同的具有血凝活性的病毒，其

12、凝集譜、發(fā)生凝集反應的條件（溫度、pH）都有可能不同,據(jù)此可以對病毒進行鑒定。 (五)病毒的免疫鑒定 免疫沉淀反應，凝集反應，酶聯(lián)免疫吸附測定，免疫瑩光技術，免疫電鏡技術、放射免疫技術、單克隆抗體技術等。 血凝抑制試驗：特異性的病毒抗體與病毒表面有凝集活性的表面蛋白結合，可抑制血細胞凝集反應發(fā)生。,中和試驗： 在病毒的中和作用（neutralization）性質(zhì)上建立，即某些特異性的病毒抗體與病毒作用后，能夠使其失去感染性，抑制病毒的繁殖。這類病毒抗體稱做中和抗體（neutralizing Abs） 。并且一種病毒的感染性只能被其特異性的中和抗體中和，而中和一定量的病毒的感染性必須有一定效價的

13、抗血清。,(六)分子生物學方法 *變性與不變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳 *蛋白質(zhì)肽圖與N末端氨基酸分析 *核酸的酶切圖譜與寡核苷酸圖譜分析 *分子雜交 *序列測定 *聚合酶鏈反應（PCR）等,第三章 毒粒的性質(zhì),第一節(jié) 描述毒粒性質(zhì)的結構術語 一、毒粒（Virion） 1、毒粒是一團能夠自主復制的遺傳物質(zhì)（DNA或RNA），它被自身編碼的蛋白質(zhì)外殼所包圍，有的還有一層附加膜，以保護其遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞，并作為將其遺傳物質(zhì)從一個宿主細胞傳遞給另一個宿主細胞的載體。 2、毒粒的基本構成：一個核酸分子（DNA或RNA） 蛋白質(zhì)外殼（由許多相同的蛋 白質(zhì)分子構成） * 有的病毒含有多個核酸分子 * 有的

14、病毒蛋白質(zhì)外殼由數(shù)種不同的蛋白質(zhì)分子構成 * 有的病毒蛋白質(zhì)外殼外還有一層膜結構 * 有的病毒的多個核酸分子被分別包裝在不同的顆粒中,3、分段基因組（segmented genome） 病毒基因組由數(shù)個核酸分子構成，只有這些核酸分子同時存在病毒才具有感染性，其各個核酸分子稱之為節(jié)段（segment）。 4、多分體病毒（multicomponent viruses）: 具分段基因組的病毒各個核酸節(jié)段分別包裝在多個顆粒中，只有這些顆粒同時存在病毒才能夠復制，個別顆粒感染病毒不能復制，多分體病毒主要見于植物RNA病毒中。,二、殼體（capsid），又稱衣殼，其同義語是外殼（coat） 包圍著病毒核酸

15、及其結合蛋白的蛋白質(zhì)鞘(shell)。 三、蛋白質(zhì)亞基（protein subunit），其同義語是原體（protomer）或結構單位（structure unit） 以次級鍵結合構成病毒殼體的蛋白質(zhì)單體。結構簡單的病毒殼體僅由大量相同的蛋白質(zhì)亞基構成，一些復雜的病毒殼體可能由多種不同的蛋白質(zhì)亞基構成。,四、殼粒（capsomer），又稱子粒，其同義語是形態(tài)學單位（morphological unit） 在病毒的二十面體殼體構成中，一定數(shù)量的蛋白質(zhì)亞基以特殊方式聚集形成的，在電鏡下可見的結構。 蛋白質(zhì)亞基 聚集 殼粒 聚集 二十面體殼體 五聚體（pentamer）:由5個蛋白質(zhì)亞基聚集形成 六

16、聚體（hexmer） :由6個蛋白質(zhì)亞基聚集形成,五、核心（core） 由病毒核酸及其結合蛋白組成，并被殼體包圍的毒粒的中心部分。一些復雜病毒的核心結構較為復雜，這類病毒的核心常稱做類核（nucleoid） 六、核殼（nucleocapsid），又稱衣殼 殼體與核心一起構成的復合物，一些簡單的病毒的毒粒就是一個核殼結構。 七、包膜（envelope），又稱囊膜 包膜是病毒核殼外的膜結構，系病毒以芽出方式（budding）成熟時，由細胞膜衍生而來的脂雙層膜，其中的膜蛋白是病毒基因編碼的。 八、釘狀物（spike） 病毒表面向外凸出的突起,多見于有包膜病毒的包膜表面,包膜表面的釘狀物稱做包膜突起（

17、peplomer）,第二節(jié)毒粒的化學組成 毒粒的基本組成包括：核酸 蛋白質(zhì) 脂類 碳水化合物 其它組分 一、病毒的核酸 （一）核酸是病毒的遺傳物質(zhì) DNA是DNA病毒的遺傳物質(zhì) Hershey chase (1952) E.Coli phage T2 攪拌試驗 RNA是RNA病毒的遺傳物質(zhì) Fraenkedl conet, singer(1955) Gierer , schrcmm (1957) Tobacco mosaic virus 體外重建試驗,(二)病毒核酸的堿基組成含量和類型 1、病毒核酸的堿基組成 病毒DNA的堿基組成： A、T、G、C 病毒RNA的堿基組成： A、T、G、U 有些

18、噬菌體的DNA中含有稀有堿基 Bacillus subtilis phage SP8 UC E.coli phage T4 5-HMCC 2、含量和分子量 不同的病毒核酸含量不同 T-even phage 50% TMV 5% Influenzavirus 1% 不同的病毒核酸的分子量差異很大 細小病毒 （Parvoviruses） 1.5x106 痘病毒 (Poxviruses) 150 x106,2、末端重復（terminal repeats） 基因組核酸分子兩端存在的相同核苷酸序列 3、倒轉末端重復（inverted terminal repeats） 基因組核酸分子兩端存在的互補核苷酸

19、序列 ABC ABC ABC CBA ABC ABC 或 ABC CBA,A,B,C,A,B,C,A,B,A,B,C,C,或,或,4、循環(huán)排列（ciraular permutation） 多個病毒顆粒中隨機包裝的雙鏈DAN分子有相同的基因順序，但末端的序列有所不同 ABCDEFGAB BCDEFGABC CDEFGABCD 5、5末端的帽子結構（Cap Strueture） 大多數(shù)真核正鏈RNA（+RNA）病毒的基因組RNA和雙鏈RNA病毒的基因組RNA的正鏈的5端均有55結合的7-甲基化鳥苷酸殘基封閉結構，其RNA鏈的第一個核苷酸亦甲基化，這種完全甲基化的末端寡核苷酸（m7G5-ppp5Nm

20、pNp）即稱做為帽子結構。,6、3末端聚腺苷酸的尾 大多數(shù)真核正鏈RNA（+RNA）病毒的基因組RNA5端具有poly(A) 7、5端共價結合蛋白 某些病毒（Adenoviruses, Hepadnaviruses）基因組核酸鏈的5端共價結合的蛋白質(zhì)。,(四)病毒核酸的類型,（1）按其鏈數(shù)劃分 線狀 ssDNA DNA dsDNA RNA ssRNA dsRNA 線狀,線狀,環(huán)狀,環(huán)狀（僅HDV）,環(huán)狀,線狀,（2）按核酸的感染性區(qū)分 *轉染：與有感染的毒粒所進行的病毒遺傳物質(zhì)傳遞相區(qū)別。將從毒粒或病毒感染的細胞中分離純化的病毒核酸直接導入細胞，現(xiàn)在已用來泛指將外源核酸直接導入培養(yǎng)的細胞。 依

21、賴宿主的轉錄酶進行轉錄的病毒DNA有感染性 依賴病毒毒粒攜帶的病毒轉錄酶進行轉錄的病毒DNA無感染性 其基因組RNA具有mRNA活性，可直接作為翻譯模板則有感染性 其基因組RNA序列與其mRNA互補，需經(jīng)病毒毒粒所攜帶的依賴于RNA的RNA聚合酶轉錄產(chǎn)生mRNA則無感染性,DNA病毒,RNA病毒,（3）按核酸的特性（polarity）或意義（sense）區(qū)分 正鏈RNA（ +RNA）：病毒基因組單鏈RNA可以作為mRNA，即具有翻譯模板 的活性，即為正極性（正意）。 負鏈RNA（-RNA）：病毒基因組單鏈RNA的核苷酸系列與其mRNA互補，經(jīng)病 毒粒攜帶的依賴于RNA的RNA多聚酶轉錄產(chǎn)生的m

22、RNA，即為負極性（負意） 雙意RNA（ambisense RNA）：病毒基因組單鏈RNA部分為正意、部分為負 意。 正鏈DNA（+DNA）：病毒基因組單鏈DNA序列與其mRNA相 同。 負鏈DNA（-DNA）：病毒基因組單鏈DNA序列與其mDNA互補 dsRNA的轉錄鏈為負鏈，另一條鏈為正鏈。 dsDNA一般不以極性定義，但HBV，HPV dsDNA中，僅一條鏈被轉錄，則轉錄鏈為負鏈，另一條鏈為正鏈。,ssRNA,ssDNA,病毒核酸類型,二、病毒蛋白質(zhì),根據(jù)其是否存在于毒粒之中分為： 結構蛋白（structure protein）：構成一個形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)，是毒粒

23、的結構組成，包括殼體蛋白、包膜蛋白、毒粒酶（存在于病毒毒粒中的病毒酶） 。 非結構蛋白（non-structure protein, NS）：由病毒基因組編碼的，在病毒復制過程中產(chǎn)生，并在病毒復制中具有一定的功能，但不結合于毒粒中的蛋白質(zhì)。,（一）殼體蛋白,構成病毒殼體結構的蛋白質(zhì)： 1、殼體蛋白的結構 由一條或多條肽鏈折疊形成，具有三級結構的蛋白質(zhì)亞基是殼體蛋白構成的最小單位，許多亞基借助次級鍵或靜電引力互相聚合形成具有四級結構的殼體。 2、殼體蛋白的功能 （1）構成病毒的殼體、保護病毒的核酸 （2）無包膜病毒的殼體蛋白參與病毒的吸附、進入、 決定病毒的親嗜性。 （3）決定病毒抗原性 （4）

24、其他生物活性，如血凝活性、細胞毒性等。,（二）包膜蛋白,存在于病毒包膜中的病毒結構蛋白，是包膜的結構組成，包括： 包膜糖蛋白（envelope glycoprotein） 基質(zhì)蛋白（matrix protein） 1、包膜糖蛋白 （1）包膜糖蛋白的結構 系由多肽骨架與寡糖側鏈，通過 -N-糖苷鍵將N-乙酰葡萄糖胺與多肽鏈的門冬酰胺殘基連接形成，分為膜外結構域（包膜突起）和跨膜結構域。,（）包膜糖蛋白類型 簡單型（高甘露糖型）糖蛋白；由N-乙酰葡萄糖胺核心單位與重復的側支甘露糖鏈構成 復合型糖蛋白：由N-乙酰葡萄糖胺核心單位和由半乳糖、巖藻糖、唾液酸及甘露糖等組成的側支糖鏈構成。,（3）包膜糖蛋

25、白的功能 A、構成病毒的包膜，保護病毒的核殼結構 B、在病毒的吸附，進入過程中具有重要作用， C、病毒表面特異性抗原，決定病毒的抗原性。 D、其他生物活性，如血凝活性（流感病毒的HA糖蛋白），神經(jīng)氨酸酶活性（流感病毒的NA糖蛋白），細胞融合活性（仙臺病毒的糖蛋白）等。,2、基質(zhì)蛋白 病毒包膜脂雙分子層與核殼之間的亞膜結構（submembrane），一般為非糖基化蛋白。 功能： （1）支撐包膜、維系包膜結構； （2）在病毒包裝時，在核殼與包膜糖蛋白的識別過程中發(fā)揮作用。,3、毒粒酶 參與病毒復制的酶來源于： （1）宿主細胞酶或經(jīng)修飾、或結合了病毒組分而改變了宿主細胞酶。 （2）病毒的非結構蛋白

26、（3）存在于病毒毒粒的毒粒酶，系由病毒基因組編碼，在病毒復制成熟過程中作為結構組分結合于毒粒內(nèi)。,三、病毒的脂質(zhì),主要存在于病毒的包膜中，包括磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂等，主要以磷脂形式存在，因病毒包膜系病毒以芽出方式成熟時由細胞膜衍生而來，故其脂質(zhì)的種類和含量與宿主細胞膜相同，具有宿主特異性。,四、病毒的碳水化合物,主要存在于有包膜病毒中，以寡糖側鏈形式與蛋白質(zhì)結合形成包膜糖蛋白。 五、其他組成 多胺類有機陽離子（如丁二胺、亞精胺、精胺等） 無機陽離子（如Fe+、Ca+ 、Mg+ 、Cu+等） 系病毒成熟時從環(huán)境中獲得的不恒定的組分。,第三節(jié) 毒粒的形態(tài)結構,一、毒粒的大小和形狀 1、毒粒的大

27、小 不同的病毒差異很大 雙粒病毒 直徑 18-22nm 痘病毒 300-450nmX170-260nm,2、毒粒的形狀 （1）球形顆粒 實際是擬球形顆粒，無包膜者常稱做等軸顆粒（isometric particles） （2）桿狀顆粒 剛直桿狀 煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV） 彎曲桿狀 馬鈴薯X病毒（Pototo virus X, PVX） 絲狀 甜菜黃花病毒（Beet yellow virus, BYV） （3）復雜形狀顆粒 如 Poxviruses , E.coli phage T4 （4）有些病毒顆粒呈多形性（pleomorphic）如Infuenze

28、viruses,二、毒粒的殼體結構,（一）病毒殼體構成的原理 1、物理學原因 （1）任何物質(zhì)結構穩(wěn)定的必要物理條件是必須處于自由能最低狀態(tài)。 （2）蛋白亞基要裝配成一個穩(wěn)定的殼體結構必須彼此之間以最大數(shù)目的次級鍵結合，如此自由能才能充分釋放，殼體處于自由能最低狀態(tài)，結構方能趨于穩(wěn)定。 （3）非對稱的蛋白質(zhì)亞基分子彼此之間欲以最大數(shù)目成鍵，必須對稱排列形成高度有序的對稱結構。,2、幾何原理 對稱結構形成： 園柱體對稱： 病毒殼體呈螺旋對稱 立方對稱：包括正四面體、正六面體、正八面體、正十二面體和正二十面體、在這些拓樸等價多面體中，當表面積一定時，以二十面體容積最大。病毒殼體呈二十面體對稱。 球對

29、稱：構成病毒殼體的蛋白質(zhì)亞基數(shù)量有限，故不可能采取球對稱形式。,（二）螺旋對稱殼體 （1）蛋白質(zhì)亞基有規(guī)律地沿著螺旋的中心軸呈螺旋排列所形成的高度有序的，對稱的穩(wěn)定結構。 （2）描述螺旋對稱殼體特征的參數(shù)：螺旋長度、螺旋直徑、軸孔直徑、螺矩、螺轉數(shù)、構成螺旋殼體的蛋白質(zhì)亞基總數(shù)，每一螺轉的蛋白質(zhì)的質(zhì)亞基數(shù)。 （3）螺旋殼體的直徑是由蛋白質(zhì)亞基的特征所決定， （4）螺旋的長度是由與殼體結合的病毒核酸分子所決定 （5）病毒核酸分子與蛋白質(zhì)亞基結合： *控制螺旋的形成 *增加殼體結構的穩(wěn)定性,例： TMV 亞基總數(shù) 2130個 螺旋殼體長度 300nm 螺旋殼體直徑 15-18nm 軸孔直徑 4nm

30、 螺距 2.3nm 螺轉數(shù) 130 每一螺轉上亞基數(shù) 16 1/3 個,（三）二十面體對稱殼體,1、二十面體的特點 二十面體是具有二十個三角面、三十條棱和十二個頂?shù)牧⒎襟w，正二十面體的三角面均為等邊三角形（基本三角面），并且具有5次、3次和2次對稱軸。 5次對稱：以相對應的頂點的連線為軸，旋轉72o，其型不變，旋轉5次復位。 3次對稱：以相對應的三角面中心的連線為軸，旋轉120o ，其型不變，旋轉3次復位。 2次對稱：以相對應的棱的中心的連線為軸，旋轉180o ，其型不變，旋轉2次復位。,2、二十面體構成的方式 （1）蛋白質(zhì)亞基嚴格等價結合構成正二十面體殼體。 Satellite tobacc

31、o necrosis virus (STNV)殼體由60個蛋白質(zhì)基構成。 60 protein subunits12pentonsicosahadron capsid,(2)蛋白質(zhì)亞基準等價結合構成二十面三角體殼體 A、構成更大、更為復雜的殼體須增加亞基數(shù)目 B、更多數(shù)目蛋白質(zhì)亞基在擴大的二十面體中須 處于等價或準等價環(huán)境方能保持結構穩(wěn)定 C、蛋白質(zhì)亞基在擴大的二十面體的基本三角面被剖分成的若干個全等三角形（亞三角形）中對稱排列。 D、二十面體三角體（icosadeltahedron）:基本三角面被剖分成的若干亞三角形的二十面體。 在二十面體三角體殼體中，二十面體殼體所有12個五鄰體仍保留，但

32、有六鄰體（hexon）在二十面體的基本三角面上形成。,3、描述二十面體殼體特征的結構參數(shù) （1）三角剖分數(shù)（T）：二十面體的每個基本三角面被分割成的亞三角形數(shù)目。 T=pf2 ,f可取任何正整數(shù)（1，2，3）P為級數(shù) （2）級數(shù)（P）：P=h2+hk+k2 ，h和k為無公因子的整數(shù)。 （3）蛋白質(zhì)亞基數(shù)（Su）：Su=60T （4）殼粒數(shù)（C） ： C=10T+2 （5）五鄰體數(shù) ： 12 （6）六鄰體數(shù) ： 10（T-1）,（四）雙對稱（bisymemetry）殼體 有尾噬菌體（tailed phage）,三、病毒的包膜結構,（一）病毒包膜的來源 系病毒出芽出成熟時從細胞膜上獲得的（除 Po

33、xviruses 外） 包括細胞質(zhì)膜 大多數(shù)包膜病毒 高爾基體 Bunyavineses 核模 Herpesviruses 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 Spumaviruses,（二）病毒包膜的結構 脂雙分子層 病毒包膜蛋白：包膜糖蛋白、基質(zhì)蛋白（有些病毒，如 Togaviruses 無基質(zhì)蛋白）,四、病毒毒粒結構的類型,1、無包膜的螺旋毒粒，以TMV為代表的多數(shù)植物病毒 2、無包膜的二十面體毒粒，如 Picornaviridae Adenoviridae , Reoviridae 3、有包膜的螺旋毒粒， 如 Orthomyxoviridae Paramyxoviridae, Bunyaviridae. 4、有

34、包膜的二十面體毒粒 ， 如 Togaviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Retroviridae 5、復雜毒粒 如 Poxviridae, Tailed phage,第四節(jié) 病毒的抗原性質(zhì),病毒毒粒及其構成中的各種蛋白質(zhì)的組分，以及病毒在復制時產(chǎn)生的非結構蛋白都是具有免疫原性和免疫反應性的有效抗原。,一、病毒的抗原分類,1、根據(jù)病毒抗原是存在于毒粒中劃分： 結構抗原 非結構抗原 2、根據(jù)結構抗原在毒粒中存在的部位劃分 表面抗原 內(nèi)部抗原 3、根據(jù)病毒抗原是否能誘導機體的抗病毒免疫保護劃分： 保護性抗原（包括中和抗原） 非保護性抗原 4、根據(jù)病毒抗原的

35、特異性劃分 科抗原（family Ags） 型特異性抗原（Type-specific Ags）,二、病毒特異性抗體,1、病毒特異性抗體 不同類型的病毒制毒物誘生的抗體種類有所不同 （1）以不能在宿主體內(nèi)繁殖的病毒毒粒，或以無活性 的動物病毒毒粒免疫動物，主要產(chǎn)生抗病毒表面抗原的抗體； （2）以能在宿主動物體內(nèi)繁殖的病毒毒粒免疫動物，可產(chǎn)生包括抗病毒表面抗原，內(nèi)部抗原和非結構抗原在內(nèi)的所有病毒抗原的抗體。 （3）以純化的毒粒某一抗原組分進行免疫，僅能產(chǎn)生針對這一組分的抗體。,2、中和抗體 （1）中和抗體作用機理：中和抗體與病毒毒粒的抗體結合位點（或抗原決定簇）結合，可以抑制病毒吸附、進入、脫殼或

36、轉錄某一感染步驟，從而阻斷病毒的復制，抑制病毒的感染。 （2）不同病毒的中和抗體的中和機理可能各有不同。 （3）同一病毒的不同類型的抗體的中和機理亦有不同。 （4）抗體可呈現(xiàn)協(xié)同作用，增加中和效應。,3、依賴抗體的增強作用（antibody dependment enhancement ） 在極少數(shù)情況下，病毒特異性抗體能增加病毒的感染，如黃熱病毒（Yellow fever viruses ）登革熱病毒（Dengue viruses） （1）發(fā)生抗體增強作用的條件 A、病毒能在單核巨噬細胞中增殖； B、機體在病毒感染之前已有對該病毒的非中和抗體或亞中和濃度的中和抗體存在。 （2）抗體增強作用的

37、機理 非中和抗體或亞中和濃度的中和抗體與病毒作用，形成病毒抗體復合物，因抗體的Fc段與單核巨噬細胞表面的Fc受體結合，從而大大增強了巨噬細胞被感染的機率。,三、病毒抗原的進化,1、抗原性漂移（antigen drift） 病毒在自然宿主內(nèi)頻繁傳代所出現(xiàn)的抗原性微小的改變，一般認為它是在宿主免疫壓力下，病毒突變體選擇的結果。 2、抗原性轉變（antigen shift） 病毒抗原突發(fā)的巨大改變，如甲型流感病毒（Influenzaviruses A）從H1N1亞型轉為新的H2N2亞型，一般認為這是病毒基因重組的結果。 3、病毒抗原進化的原因 病毒的抗原進化是其編碼基因突變累積的結果，在動物機體內(nèi)生

38、態(tài)環(huán)境中進化的病毒受到中和抗體的抵抗，病毒的進化必然選擇與中和作用有關的抗原決定簇的突變，而影響其它抗原位點的突變不會被選擇出來。,第五章 病毒的復制,第一節(jié) 病毒的增殖性感染與復制周期 一、病毒的增殖性感染 1、感染是指病毒以毒粒作為載體將其遺傳物質(zhì) 傳遞給細胞，其中包括病毒吸附進入過程； 2、根據(jù)病毒是否能夠感染進入細胞可分： 敏感細胞（sensitive cells）：病毒能夠感染進入的細胞 非敏感細胞（non-sensitive cells）:病毒不能夠感染進入的細胞,3、病毒進入細胞后并不一定能成功進行復制，產(chǎn)生有感染性的子代病毒，因此細胞還可據(jù)此分為： 允許細胞（permissiv

39、e cells）:病毒在其中能夠復制的細胞 非允許細胞（non-permissive cells）:病毒在其中不能夠復制的細胞 4、根據(jù)病毒感染后能否進行復制、繁殖產(chǎn)生子代病毒，可將其分為： 增殖性感染（productive infection） 非增殖性感染（non-productive infection）,二、一步生長試驗（one step growth experiment）,1、概念：處于特殊培養(yǎng)的細胞被病毒同步感染，以致可由整個細胞群體所發(fā)生的病毒復制事件，推知單個細胞所發(fā)生的病毒復制事件。 2、方法： （1）以適量的病毒接種處于標準條件下培養(yǎng)的高濃度的敏感細胞（低感染復數(shù)感染，以

40、使一個細胞只被一個病毒感染） （2）待病毒吸附后，或是高倍稀釋病毒細胞培養(yǎng)物，或是用抗病毒血清處理病毒細胞培養(yǎng)物（建立同步感染）。 （3）已處理的病毒細胞培養(yǎng)物繼續(xù)置標準條件下培養(yǎng)。 （4）間時取樣，測定培養(yǎng)物感染中心（infective center）的數(shù)目，即游離的有感染性的病毒顆粒數(shù)目和病毒感染的細胞數(shù)目。 （5）以感染時間為橫座標，以病毒感染率為縱座標作圖，得到病毒繁殖的一步生長曲線（one step growth curve),3、一步生長曲線：,由一步生長曲線可獲得病毒復制的兩個特征性數(shù)據(jù) （1）潛伏期（latent period）:自病毒吸附于宿主細胞到受染細胞釋放出子代病毒的最

41、短時間。 （2）裂解量（burst size）:每個受染細胞（infected cells）新產(chǎn)生的子代病毒的平均數(shù)目。由于一步生長試驗的設計依據(jù)是：一個細胞僅被一個病毒感染。 故 裂解量=穩(wěn)定期受染細胞所釋放的全部病毒子代數(shù)目/潛伏期受染細胞數(shù)目 =穩(wěn)定期感染中心數(shù)目/潛伏期感染中心的數(shù)目 =穩(wěn)定期病毒效價/潛伏期病毒效價,三、病毒的復制周期 病毒復制周期：自病毒吸附于細胞開始，到子代病毒從受染細胞釋放出來為止的病毒復制全過程。依其發(fā)生的病毒復制事件可為分下階段： 1. 吸附 2. 進入和脫殼 3. 病毒生物大分子合成： 病毒基因組復制產(chǎn)生子代病毒基因組 病毒基因組表達產(chǎn)生病毒復制和包裝所

42、需的蛋白質(zhì)。 4. 裝配與釋放,第二節(jié) 病毒的吸附,一、吸附（attachment或adsorption）的概念： 病毒依賴其表面吸附蛋白與細胞受體的相互作用而固著于細胞表面。 二、病毒的吸附過程 1、初始吸附 2、粘附增加作用,三、病毒吸附蛋白（virus attachment protein, VAP） 病毒毒粒表面能夠識別特異性的細胞受體，從而導致吸附反應發(fā)生的病毒結構蛋白。 如： E.coliphage T4 尾絲蛋白 Influenzaviruses HA糖蛋白 Paramyxoviruses HN糖蛋白 Adenoviruses 五鄰體纖維,四、病毒的細胞受體（病毒受體） 1、病毒

43、受體：宿主基因組編碼、控制表達的一組能與病毒相互識別和結合，以啟動病毒感染的細胞膜表面的分子，其大多數(shù)蛋白質(zhì)，亦可能為糖蛋白或磷脂。,2、病毒受體的性質(zhì) 病毒受體分子并非為病毒感染特異性單獨表達的，它們可能是細胞的特定受體，亦可能是特殊受體之外的膜蛋白分子。 （1）病毒受體數(shù)量的有限性。 （2）病毒受體細胞表面分布的不均勻性； （3）病毒受體的特異性。 A、細胞的種系特異性；決定了病毒的宿主范圍。 B、組織特異性；決定了病毒的組織嗜性 C、病毒特異性；不同種類的病毒，具有不同的病毒受體。同種不同型的病毒，甚至同型病毒不同毒株亦可能有不同的病毒受體。,3、輔助受體（coreceptors）或第二

44、受體（secondary receptors） 在病毒與細胞表面的初始結合受體（primary binding receptors）結合后。某些病毒亦需與病毒輔助受體相互作用，才能導致病毒的吸附進入。這種在病毒與細胞初始結合后，能夠結合毒粒及其發(fā)生變化了的形式的細胞表面分子稱之為輔助受體或第二受體。 如：參與 HIV-1、HIV-2不同毒株感染的趨化因子受體 CCR5、CCR3、CCR8、CXCR4等，參與痘病毒吸附的 HveA 、 HveB 、HveC mediators.,第三節(jié) 病毒的進入與脫殼,一、病毒的進入 病毒吸附于細胞表面，能以不同的方式進入細胞。 動物病毒進入細胞的方式有：移位

45、、內(nèi)吞、病毒包膜與細胞質(zhì)膜融合、抗體依賴的增強作用等方式。,1、移位（translocation） 一些無包膜的二十面體病毒進入細胞的方式。在受體介導下發(fā)生，機制尚不明確，如Polioviruses. 2、內(nèi)吞作用(endocytosis) （ 1） 不依賴pH機制：病毒進入過程在生理pH條件下進行。 A、病毒直接在細胞質(zhì)膜進入（病毒包膜與細胞質(zhì)膜融合） B、繼病毒-受體復合物后，病毒從吞噬體（phagosome）裝置內(nèi)進入。（吞噬作用） （2）依賴pH機制 病毒-受體復合物進入酸性pH環(huán)境的內(nèi)體（endosome）內(nèi)，在病毒融合肽的介導下，病毒包膜與核內(nèi)體膜融合，病毒進入。（受體介導的內(nèi)吞）

46、,3、病毒包膜與細胞質(zhì)膜融合,在生理pH條件下，病毒包膜糖蛋白（如Paramyxoviruses 的 F 糖蛋白，HIV的 gP120 糖蛋白）中的融合肽介導病毒包膜與細胞質(zhì)膜融合，病毒進入細胞。根據(jù)膜融合通用模型（satalkny pothesis 基狀假設） ，即基于膜的水合作用 、曲率 、張力的變化和半融合（semifusion）初反應，這些變化都有助于病毒的包膜與細胞質(zhì)融合。,4、以抗體依賴的增強作用方式進入 病毒與亞中和濃度的病毒特異性抗體結合，所形成的病毒-抗體復合物可通過與細胞表面的免疫球蛋白受體的結合進入細胞。 通過 Fc 受體以抗體的增強作用的進入細胞的病毒有 Dengue

47、viruses 、 west Nile viruses 、 Influenza A viruses 和 HIV-1、HIV-2 等。,二、病毒的脫殼（uncoating） 病毒進入細胞后，必須經(jīng)過脫殼，即除去蛋白質(zhì)的外殼，釋放出的病毒基因組方能進行復制和功能表達。但在目前為止，對于病毒脫殼的分子機理所知甚少。 1、 有些病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒（Polioviruses）的正鏈RNA基因組直接進入細胞質(zhì),而其他大多數(shù)病毒是以病毒核蛋白復合物（viral nucleoprotein complexes）形式進入細胞，以此形式進入細胞后都須經(jīng)過一系列的去裝配（disassembly）步驟進行脫殼。

48、2、病毒與宿主細胞受體結合后，病毒與受體多價的相互作用，可能引起病毒殼體蛋白的重排，必有助于病毒脫殼，釋放病毒核酸。,3、病毒脫殼涉及蛋白水解酶，熱裂解等因子的作用，此過程依賴于溫度，大多數(shù)病毒脫殼的最適合溫度是35-38。 4、利用毒粒攜帶的依賴于DNA的RNA多聚酶（DdRp）進行轉錄的DNA病毒、利用毒粒攜帶的依賴于RNA的RNA多聚酶（RdRp）進行轉錄的雙鏈RNA病毒和負鏈RNA病毒、利用毒粒攜帶的逆轉錄酶（RdDp）進行復制的逆轉錄病毒，即具有非感染核酸的病毒都不完全脫殼，均以核蛋白體形式進入細胞 。雙鏈RNA病毒、負鏈RNA病毒及逆轉錄病毒則稱之為核糖核蛋白體（ribonucle

49、oprotein ， RNP）。如 Infuenzaviruses 的 RNP ，即由其負鏈RNA基因組、核蛋白（NP）和RdRp(包括PA、PB1、PB2)組成。,第五節(jié) 病毒大分子的合成,一、病毒大分子合成的基本過程 1、病毒基因組早期基因的表達（轉錄或 翻譯） 2、病毒基因組的復制 3、病毒基因組晚期基因的表達（轉錄或翻譯）,二、病毒大分子合成的控制,1、病毒大分子合成的空間分布 （1）RNA病毒：絕大多數(shù)RNA病毒在細胞質(zhì)內(nèi)復制，但亦有如 Influenzaviruses（須切割宿主細胞的mRNA的帽子結構為病毒基因組復制的引物），Retroviruses（須利用宿主細胞的 DdRp

50、II 進行轉錄）在細胞核內(nèi)復制。 （2）DNA病毒：絕大多數(shù)DNA病毒在細胞核內(nèi)復制，但有如 Poxviruses（利用毒粒酶 DdRp 進行轉錄）在細胞質(zhì)內(nèi)復制。,2、病毒大分子合成的時序性 病毒大分子的合成有強烈的時序性，這種時序性主要表現(xiàn)為基因組轉錄的時間組織（temporal organization），即大多數(shù)病毒的基因組是分早、晚期進行。 （1）早期轉錄：病毒核酸復制之前所進行的轉錄，早 期轉錄的基因為早期基因，轉錄產(chǎn)物為早期mRNA 。早期mRNA翻譯產(chǎn)生早期蛋白，主要是參與晚期基因表達，病毒核酸復制，改變和抑制宿主細胞的大分子合成的非結構蛋白。 （2）晚期轉錄：病毒核酸復制開始

51、或復制后進行的轉錄，晚期轉錄的基因為晚期基因，轉錄產(chǎn)物為晚期mRNA 。晚期mRNA翻譯產(chǎn)生晚期蛋白，主要是形成病毒毒粒的結構蛋白，以及參與病毒毒粒裝配與釋放的調(diào)控蛋白。,（3）有些病毒轉錄的時間組織更為復雜 如 E.coli phage T4 分為: 即早期(immediate early ， IE) 遲早期(delayed early DE) 中 期(middle ， M) ，亦稱準晚期 (quasi-late) 晚 期(late ， L) Herpesviruses 分為: 即早期 (IE) 基因:包括0、4、22、27 等 早 期 (E) 基因:包括 1 、 2 等 晚 期（L) 基因

52、:包括 1 、 2 等 （4） 有些病毒基因的轉錄不表現(xiàn)時序性.,3. 病毒大分子合成與宿主細胞的適應。 （ 1）原核生物病毒（噬菌體）。 a. 原核生物病毒的基因為連續(xù)基因 b. 轉錄與翻譯相互偶聯(lián) c. 一般不具有轉錄后的加工 d. 翻譯可從mRNA內(nèi)部起始，從而將一多順反子的mRNA翻譯成多個不同的功能蛋白質(zhì),（2）真核生物病毒 a. 真核病毒基因為割裂基因； b. 轉錄和翻譯不相互偶聯(lián)； c. 轉錄后的加工： mRNA 5末端加帽， mRNA 3末端聚腺苷化，mRNA轉錄后的拼接， mRNA甲基化。 d. 翻譯一般不能從mRNA內(nèi)部起始，真核病毒發(fā)展了不同的表達策略，以克服這一障礙。,

53、* 病毒基因組由數(shù)個核酸分子組成，分段基因組的每一個節(jié)段（除少數(shù)節(jié)段例外）均為單基因。 如 Reoviruses ， Orthomyxoviruses,* 以轉錄終止-再起始機制，將多順反子的病毒基因組轉錄為多種不同的單順反子mRNA 。如 Paramyxoviruse ， Rhabdoviruses.,* 轉錄產(chǎn)生多順反子的初級轉錄本、經(jīng)切割、拼接產(chǎn)生單順反子的mRNA，包括大多數(shù)DNA病毒和某些RNA病毒，如Retroviruses。,* 病毒的整個RNA基因組（如Picornaviruses）或部分RNA基因組（如Togaviruses ， Coronaviruses），直接翻譯成為一聚

54、蛋白前體，再經(jīng)蛋白酶水解切割產(chǎn)生不同的功能蛋白質(zhì)。,3、RNA病毒的復制,（1）RNA病毒基因組的復制和mRNA合成策略,（2）病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp） 1960年在Polioviruses和Mengoviruses的研究中發(fā)現(xiàn)依賴于RNA的RNA聚合酶。 A、病毒的RNA聚合酶通常為由幾個病毒基因產(chǎn)物構成的多亞單位裝配物，如Influenzavmses的RdRp由PA,PB1,PB2組成。 B、按照在感染中的活性，病毒的RdRp可分為： 復制酶：從病毒RNA復制產(chǎn)生子代基因組 轉錄酶：從病毒RNA轉錄產(chǎn)生mRNA

55、。 C、病毒的RdRp缺乏校讀活性，故病毒RNA復制的堿基錯配率很高（高于DNA復制的10,000倍以上），這亦是RNA病毒頻于變異的原因。,（3）病毒的逆轉錄酶（retrotranscriptase, RT） 1970年，Baltimore和Temin分別在勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma viruses）和禽白血病病毒（Avian leucosis viruses）的研究中發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶。 A、逆轉錄酶具有四種酶活性： 依賴于RNA的DNA多聚酶（RdRp）活性。 依賴于DNA的DNA多聚酶（DdDp） 解旋酶活性 RNaseH活性 B、逆轉錄酶在以RNA作為模板進行DNA合成的過程中

56、（RdDp活性）亦缺乏校讀活性，故在在復制過程中有逆轉錄階段的RNA病毒（Retroviruses）和DNA病毒（Hepadnaviruses）突變率高，頻于變異。,（4）RNA病毒的轉錄 A、轉錄方式的轉錄：產(chǎn)生不完全轉錄本，作為mRNA。 B、復制方式轉錄：產(chǎn)生完全轉錄本，作為子代鏈或子代鏈合成的模板。,（5）RNA病毒的翻譯 A、5端有帽子結構的正鏈RNA病毒的基因組RNA，負鏈RNA病毒和雙鏈RNA病毒的mRNA，以依賴于5帽子的掃描機制進行翻譯。 B、5端無帽子結構的正鏈RNA病毒（如Picornaviruses）以內(nèi)部核糖體結合機制進行翻譯。 內(nèi)部核糖體進入位點（Internal

57、ribosome entry site, IRES）,RNA病毒的轉錄策略,4、DNA病毒的復制,(1)痘病毒（如Poxviruses）的復制示意圖,（2）皰疹病毒（如Herpesviruses）的復制示意圖,（3）嗜肝DNA病毒（如Hepadnaviruses）復制示意圖,（4）多瘤病毒（如Polyomaviruses）復制示意圖,第五節(jié) 病毒的裝配與釋放,一、病毒的裝配1、自我裝配(self assembly)病毒的殼體蛋白亞基以結晶作用的方式自發(fā)地裝配成病毒殼體.2、指導裝配（directive assembly）有病毒基因組編碼的某些非結構蛋白，即形態(tài)發(fā)生因子（morphogentie

58、 factor）是與分子病毒，殼體裝配。 形態(tài)發(fā)生因子的功能： （1）腳手架蛋白（scaffolding protein）,在病毒殼體過程中具有瞬時功能，但是不結合入病毒體結構中，一旦病毒殼體裝配成熟，腳本架蛋白便從病毒殼體中除去，或是被水解，或是與下一輪病毒殼體裝配。 （2）蛋白質(zhì)水解切割，在大多數(shù)噬菌體或動物病毒裝配過程 ，毒粒的成往往需要在前頭部（prehead）或前毒粒（previrion）形成后，對其中較大的前體蛋白的進行切割加工。,3、病毒的包裝層號（packacing single） 病毒基因組能與殼體蛋白相通過識別、結合起始包裝的順式作用元件。 如Retroviruses Hepatitis Bvirus(HBV)序列 4、病毒的包裝容量 對于具二十面體殼體的病毒而言由于形成空殼（empty capsid）后再進行核核酸的包裝，所以存在包裝容量的限制。如Ademoviruses的殼體所能包裝DNA的容量不能超過基因組長