1、中藥制劑理化鑒別的方法,第一節(jié) 必備知識 一、理化鑒別的意義 中藥制劑的理化鑒別是利用其藥味(原料藥)中的某種或某類指標性成分的理化性質，通過化學分析方法和儀器分析方法，檢測有關成分在制劑中是否存在，進而對所含藥味與處方的一致性做出判斷，達到鑒定藥品真?zhèn)沃康摹?藥品真實性的檢定是藥品質量控制的重要內容，是評價藥品質量的重要依據(jù)。如果藥品缺乏真實性，則可判定為不合格藥品，并以假藥論處。,二、理化鑒別的特點,理化鑒別是以制劑藥味中的指標性成分（主要為有效成分或特征性成分）為檢測對象，故可以更加客觀深刻地評價藥品的真實性。對于液體制劑或其它不含原料藥粉的制劑，理化鑒別則顯得為重要。,三、理化鑒別的

2、方法,目前中國藥典收載的理化鑒別方法有：一般化學鑒別法、微量升華法、熒光鑒別法、分光光度法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。 其中色譜法尤其是薄層色譜法得到廣泛的應用，這主要是由于色譜法具有分離分析雙重功能，從而大大提高了鑒別工作的靈敏度和專屬性，并成為今后中藥制劑鑒別的發(fā)展方向。,中國藥典（2005）新增中成藥（116種）鑒別方法,第二節(jié) 一般化學反應法 （ general chemical reaction）,一、原理 一般化學反應法是利用檢測試劑與制劑中的指標性成分發(fā)生化學反應，根據(jù)所產生的顏色、沉淀或氣體等現(xiàn)象，來判斷某些成分或某些藥味的有無。由此可見，所謂一般化學反應法即通

3、常所說的顯色反應和沉淀反應。,二特點 1.一般化學反應法具有操作簡便，適用性較強等特點。 2.其否定功能往往強于肯定功能,專屬性較差。 3.易發(fā)生假陽性或假陰性反應,假陽性或假陰性反應克服方法如下： 對樣品進行預處理，除去干擾性成分，富集被檢成分。 選用專屬性較強的檢測試劑。 必要時做陽性或陰性對照試驗加以驗證，保證其專屬性和靈敏度。,三、常用的一般化學反應,主要用于制劑中生物堿、黃酮類、蒽醌類、皂苷、香豆素、萜類以及各種礦物類成分的鑒別 （一）生物堿 1. 碘化鉍鉀反應 產生紅棕色沉淀 2. 碘化汞鉀反應 產生類白色沉淀 3. 硅鎢酸反應 產生白色沉淀 4. 苦味酸反應 產生黃色結晶性沉淀

4、需在酸性條件下進行。注意事先排除其它成分的干擾。少數(shù)生物堿不與上述通用沉淀試劑反應，而具有專屬性較強的其它反應。,（二）黃酮類化合物,最多使用的檢識反應為鹽酸鎂粉反應，呈紫紅色。大山楂丸（山楂）、抗骨增生丸（淫羊藿）、參茸保胎丸（黃芩）等。此外，黃芩提取物采用二氯氧鋯-鹽酸顯色反應進行檢識。 （三）蒽醌類化合物 主要應用堿液反應（borntrager反應），陽性反應呈紅色，加酸紅色褪去呈黃色。例如大黃流浸膏。,（四）皂苷,常用的定性鑒別反應有： 泡沫反應 樣品水溶液振搖后，產生持久性泡沫。 醋酐濃硫酸反應 甾體皂苷呈現(xiàn)污綠色，三萜皂苷呈現(xiàn)紅、紅紫色。 濃硫酸反應 呈現(xiàn)紅、紅紫色。 三氯化銻或五

5、氯化銻反應 氯仿液呈紫蘭色。 氯仿濃硫酸反應 氯仿層出現(xiàn)紅色或蘭色，并具綠色熒光。 例：地奧心血康膠囊（黃山藥和穿山龍薯蕷的提取物）、養(yǎng)心定悸膏（甘草、紅參、麥冬）。,（五）香豆素、內酯類和酚類,常用的檢識反應有： 氯亞氨基-2，6-二氯醌-四硼酸鈉反應（gibbs反應），呈現(xiàn)藍色。 異羥肟酸鐵反應 呈紅色。 應用品種有：養(yǎng)陰清肺膏（牡丹皮）、前列舒丸（牡丹皮）等。,（六）揮發(fā)性成分 主要使用香草醛濃硫酸反應檢識此類成分，正反應呈紅、紅紫色。應用品種主要有：萬應錠（冰片）、牛黃解毒片（冰片）、養(yǎng)心定悸膏（桂枝、生姜）等。,（七）礦物藥,朱砂、石膏、雄黃等為中成藥中常見的礦藥。 1.朱砂（主含h

6、gs） 主要采用銅片反應。 hgs+2hcl+cucucl2+hg（白 ）+h2s 天王補心丹等中成藥中朱砂的鑒定。 2.石膏、牡蠣、海螵蛸等 此類藥物均富含鈣鹽，主要采用草酸銨反應 。 caso4+(nh4)2c2o4cac2o4（白）+(nh4)2so4 cac2o4溶于鹽酸，難溶于醋酸。 cac2o4+2hclcacl2+h2c2o4 止咳桔紅口服液（石膏）、安胃片（海螵蛸）、龍牡壯骨顆粒（牡蠣、龍骨、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣等）,3.雄黃（主含as2s2） （1）氯化鋇沉淀法（檢出硫） as2s2+kclo3+4hno3 2k3aso3+h2so4+cl2+4no h2so4+bacl2 b

7、aso4（白） 牙痛一粒丸 （2）硫化氫反應（檢出砷） 2as2s2+7o2 2as2o3+4so2 as2o3+3h2o 2h3aso3 2h3aso3+3h2s as2s3(黃)+6h2o as2s3在鹽酸中析出黃色沉淀，并溶于碳酸銨中 4as2s3+12(nh4)2co3 4(nh4)3aso3+4(nh4)3ass3+12co2 小兒驚風散等。,o,（八）動物藥,常含有較多的蛋白質或氨基酸、故鑒別此類藥物，常使用茚三酮反應，正反應呈紅紫色。 例如：龜齡集（鹿茸、海馬、等）、參茸保胎丸（阿膠、鹿茸）等。,四、操作方法,（1）供試液的制備（見前述） （2）操作方式 大多為試管反應 ，或在檢

8、測試紙上、或在蒸發(fā)皿（坩堝）中進行反應,五、結果判斷 將反應現(xiàn)象或結果與藥品標準對照，若一致則符合規(guī)定。若不一致則判定為不符合規(guī)定。,六、注意事項, 試管反應一般使用210cm試管，取供試液12ml。加入檢測試液時，試管應稍傾斜，試液應沿試管內壁逐滴加入，滴管下口不得觸及內壁。 加入反應試液后一般需振搖試管，使之與供試液混勻。振搖時應緩緩搖擺振搖，不得上下振搖，手指不允許堵塞試管口，若需層反應，則不得振搖試管。 一般需在白色背景下觀察反應所產生的顏色或沉淀，若沉淀為白色或類白色則需在黑色背景下觀察。 如果反應需加熱，一般在水浴中加熱。用試管夾夾持試管，內容物不得超過容積的2/3，試管應傾斜45

9、度，試管口不得閉塞，并不得朝向人。加熱有機溶液絕對不允許使用明火熱源。 如果反應需無水條件，必須保持試管、蒸發(fā)皿等容器的干燥，例如醋酐濃硫酸反應。,七、應用實例,1.千柏鼻炎片 2.小兒清熱止咳口服液 3.茴香橘核丸 4.地奧心血康膠囊 5.養(yǎng)陰清肺膏,6.安胃片 7.天王補心丹 8.牙痛一粒丸 9.中風回春片,第三節(jié) 升華鑒別法（sublimation）,一、原理 本法是利用某些成分的升華性，在一定溫度下將其從制劑中升華分離出來，并以升華物所具有的某些理化性質作為制劑鑒別的依據(jù)。,二、特點 升華法具有簡便、實用等特點，由于升華性僅為少數(shù)中藥化學成分所具有且升華物純度較高，故該法專屬性亦較好。

10、,三、操作方法 大多采用微量升華法，少數(shù)使用坩堝法或蒸發(fā)皿法，在此，僅介紹微量升華 。,六味地黃丸中冰片升華物,六味地黃丸中冰片升華物顯微鏡下觀,六味地黃丸中冰片升華物香草醛濃硫酸顯色,四、注意事項 升華時應緩緩加熱，溫度過高，易使藥粉焦化，在載玻片上產生焦油狀物，影響對升華物的觀察或檢識。溫度的控制可通過調整酒精燈火焰與石棉板的間距來實現(xiàn)。 樣品粉末用量一般約0.5g，過少不易產生足夠量的升華物。 可在載玻片上滴加少量水降溫，促使升華物凝集析出。 無金屬片，可用載玻片代替。,五、應用實例（p58）,(一) 萬應錠的鑒別 （二）小兒驚風散的鑒別（反應機理） （三）明目地黃丸的鑒別,第四節(jié) 熒光

11、鑒別法（fluorescence）,一、原理 熒光鑒別法是利用制劑中某些成分，如黃酮類、蒽醌類、香豆素類等在可見光或紫外光照射下能產生一定顏色熒光的性質，對中藥制劑進行鑒別。有的成分本身不具熒光性，但加酸、堿處理后，或經其它化學方法處理后也可產生熒光供鑒別用。,二特點 本法操作簡便、靈敏，具有一定的專屬性。例如大黃和土大黃 ，前者顯棕色至棕紅色熒光，而后者顯亮藍色熒光，很容易區(qū)分。,三、操作方法 取中成藥的提取液點加于濾紙上或加入蒸發(fā)皿中，置紫外光燈（365nm）下約10cm處觀察所產生的熒光。必要時可在供試品上加酸、堿或其它試劑，再觀察熒光及其變化。,四、注意事項 熒光強度較弱，故一般需在暗

12、室中觀察熒光。 供試液一般用毛細管吸取，少量多次點加在濾紙上，使斑點集中且具有一定濃度。 紫外光對人的眼睛和皮膚有損傷，操作者應避免與紫外光較長時間接觸。,五、應用實例（p59） （一）元胡止痛片 （二）五味麝香丸 （三）熱炎寧顆粒,第五節(jié) 薄層色譜鑒別法（thin layer chromatography tlc）,一、原理 基于相同物質在同一的色譜條件下，表現(xiàn)出相同的色譜行為這一基本規(guī)律，在同一塊薄層板上點加供試品和對照物，在相同條件下展開，顯色檢出色譜斑點后，將所得供試品與對照物的色譜圖進行對比分析，從而對藥品進行定性鑒別。,二、特點 （一）簡便、快速、易普及、具有分離和分析雙重功能，且

13、采用共薄層對照分析法，故專屬性亦較強。 （二）系統(tǒng)適用性試驗。(05版藥典新增) 1.檢測靈敏度 2.分離度 3.重復性,1.檢測靈敏度 主要用于限量檢查.采用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若干倍（10倍）的對照品溶液在規(guī)定的色譜條件下，于同一塊薄層板上點樣、展開、檢視，后者應顯示清晰的斑點。,2.分離度 用于鑒別時，對照品溶液與供試品溶液中相應的主斑點，應顯示兩個清晰分離的斑點。用于限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，除另有規(guī)定外，分離度應大于1.0。,分離度（r）的計算公式為： r=2(d2-d1)/w1+w2 式中 d1為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離； d2為相鄰兩

14、峰中前一峰與原點的距離； w1 及w2為相鄰兩峰各自的峰寬；,3.重復性 主要用于含量測定.即同一供試品溶液在同一塊薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標準偏差(rsd)應不大于3.0%；需顯色后測量的相對標準偏差應不大于5.0%。,（三）對照物的設置 對照物分為對照品（主要為有效成分和特征性成分的單體）、對照藥材和對照提取物三種。 對照物的設置有四種方式： 設置一種或數(shù)種對照品 設置對照提取物 設置一種或數(shù)種對照藥材 同時設置對照品和對照藥材(“雙對照”)，它要求樣品色譜圖中的主斑點應與對照品和對照藥材色譜圖中的有關斑點相一致，從而大大提高了薄層色譜鑒別法的專屬性和整體性，可有效地

15、檢出藥品是否使用了假冒藥材.,（四）tlc已廣泛用于中藥材及其制劑的檢驗，成為中藥鑒別的重要方法和鮮明特色。 （五）中國藥典大多數(shù)品種采用硅膠薄層色譜法，少數(shù)使用聚酰胺薄層色譜法和氧化鋁色譜法。 薄層色譜法還可用于藥品的雜質檢查和含量測定。,三、影響薄層色譜鑒別的主要因素 影響因素較多，例如供試液的凈化程度，吸附劑的性能和薄層板的質量、點樣（原點）的質量、展開劑的組成和飽和情況、對照品的純度、展開的距離、相對濕度和溫度等。重點介紹展開劑、相對濕度、溫度和ph值的影響。,四、儀器與材料,（一）薄層板 1.市售薄層板（亦稱預制薄層板） 除另有規(guī)定外，一般要求使用市售薄層板。市售薄層板分普通薄層板和

16、高效薄層板兩種。常用的有硅膠薄層板、硅膠gf254薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。,2.自制薄層板 在保證色譜質量的前提下，如需對薄層板進行處理和化學改性，以適應供試品分離的要求時，也可用實驗室自制的薄層板，除另有規(guī)定外，玻板可用10cm10cm、10cm15cm、20cm10cm、20cm20cm不同規(guī)格的，最常用的固定相有硅膠g、硅膠gf254、硅膠h、硅膠hf254等。其顆粒大小，一般要求直徑為1040m。薄層板采用濕法制備，即使用涂布器將制好的固定相糊均勻涂布于玻板上。所用涂布器應能使固定相在玻板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。涂布器有手動、半自動、全自動等類型。,不同規(guī)格的薄

17、層板,鋪制薄層板,（二）點樣器材 為了增強藥品定性鑒別的可比性，中國藥典規(guī)定采用定量點樣。最常用的是微升毛細管（定容毛細管），為了提高點樣效率和質量，還可用點樣輔助設備，如點樣支架、半自動或自動點樣器。,（三）展開容器 應使用專用的展開缸，展開缸有水平式及直立式兩種類型。上行展開一般使用直立展開缸，它又分為平底式和雙槽式，雙槽展開缸具有節(jié)省溶劑、便于預平衡、可控制展開箱內的濕度等優(yōu)點。 展開缸蓋子應能密閉，體積應與薄層板大小相適應。不能用生物標本缸等其它玻璃器皿作為展開缸，否則影響展開質量。,全自動點樣儀,微升毛細管,雙槽展開缸,（四）顯色（檢視）裝置 展開后的薄層板，一般需采用相應的顯色（檢

18、視）方法使板上的被檢成分斑點顯色。 噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻霧狀噴出； 浸漬顯色可用專用玻璃器皿或適宜的展開缸做為浸漬槽； 蒸氣熏蒸顯色可在雙槽展開缸或大小適宜的干燥器中進行；熒光檢視裝置為裝有可見光、254nm及365nm紫外光源和相應濾光片的暗箱，可附加攝像設備供拍照圖像用，暗箱內光源應有足夠的光照度。,噴霧顯色,熒光顯色,五、操作方法 一般操作步驟為： 薄層板制備（制板）點樣展開顯色與檢視 （一）薄層板制備 1.市售薄層板 臨用前一般應在活化分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。如在貯放期間被空氣中雜質污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶劑在展開缸中

19、上行展開預洗，110活化，放干燥器中備用。,2.自制薄層板 除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水（或0.20.5羧甲基纖維素鈉水溶液）在研缽中向同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平穩(wěn)地移動涂布器進行涂布，取下涂好薄層的玻璃板，置水平臺上室溫下晾干后，在 烘30分鐘活化，立即置干燥器中備用。薄層板一般要求新鮮制備，當天使用。使用前應在反射光及透射光下檢查其質量，若板面不均勻、不平整或有麻點、有氣泡、有破損及污染等情況，應棄去不用。,（二）點樣 1.供試品溶液的制備 主要采用浸漬法、回流以及超聲等方法提取，液液萃取法或固液萃取法進行精制。有的成分在藥品中是以苷或酯等結合態(tài)存

20、在，檢驗前需水解成游離態(tài)再與相應的對照品一同展開分離、鑒別。 如萬應錠中熊膽的鑒別、定坤丹中人參和三七的鑒別和牛黃上清丸中大黃的鑒別。,2.原點的點加 除另有規(guī)定外，在干燥潔凈的環(huán)境，用專用毛細管或半自動、自動點樣器械點樣于薄層板上形成原點。原點一般為圓點狀或窄細的條帶狀。原點基線距板底邊1015mm，高效板原點基線離底邊810mm。圓點狀原點直徑一般不大于3mm；條帶狀的寬度一般為510mm。高效板條帶寬度為48mm，原點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜，一般不少于8mm，高效板樣品間隔不少于5mm。毛細管接觸點樣時應少量多次點加，才能保證原點小而圓。還需注意勿損傷薄層表面，點加條帶原

21、點時應注意條帶的均勻性，用噴霧狀條帶點樣器，可保證點樣的質量。,（三）展開 點樣后的薄層板放入加有展開劑的展開缸中，密閉，一般采用上行一次展開。薄層板浸入展開劑的深度以液面距原點5mm為宜，溶劑前沿達到規(guī)定的展距后，取出薄層板，晾干，待檢測。一般上行展開815cm，高效板上行展開58cm。必要時可進行二次展開或雙向展開。 例如，益氣養(yǎng)血口服液中陳皮的薄層鑒別即采用二次展開，先以乙酸乙酯甲醇水吡啶（10017135）展至3cm，取出晾干；再以甲苯乙酸乙酯甲醇水（201011上層）展至8cm，取出晾干。,展開前一般需用展開劑對展開缸進行預平衡，即使缸內展開劑氣液兩相達到動態(tài)平衡，該過程亦稱“飽和”

22、。為此可在展開缸內加入適量展開劑，密閉，保持1530分鐘。預平衡后，迅速將薄層板放入展開缸中，立即密閉，展開。若薄層板需同時預平衡，可將點樣后的薄層板放入雙槽展開缸的一側槽中，另一側槽中加入展開劑，如上法預平衡后，再將展開劑移入放有薄層板的槽中，展開。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復使用。展開劑配制后若分層，則應按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層）使用。,（四）顯色與檢視 1.顏色較深的成分可直接在日光下檢視其斑點。 2.無色或淺色的成分多用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或再加熱使之顯色，在日光下檢視。 3.有熒光的物質或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質可在紫外燈（365nm）下觀察熒光色

23、譜。 4.有的成分可用試劑的蒸氣熏蒸（如碘蒸氣、氨蒸氣）顯色。 5.某些無色有紫外吸收且不產生熒光的成分可用熒光淬滅法顯色。即在含有熒光劑的硅膠板（如硅膠gf254板），在紫外光燈（254nm）下觀察板面上該成分形成的熒光淬滅色譜。,gf254薄層板,gf254薄層板在熒光燈下,熒光淬滅法的gf254薄層板,六、記錄 薄層色譜圖象可采用攝像設備拍照，以光學照片或電子圖象的形式保存。也可以用掃描儀記錄相應的色譜圖。,薄層色譜數(shù)碼 相機成像系統(tǒng),七、結果判斷 供試品色譜中，在與對照品、對照藥材或對照提取物色譜的相應的位置上，顯相同顏色或熒光的斑點，則判斷為符合規(guī)定。,八、應用實例 （一）六味地黃丸

24、中牡丹皮的鑒別,1.丹皮酚；25.六味地黃丸,112.一捻金；13.人參二醇+人參三醇,（二）一捻金中人參的鑒別,（三）龜齡集中人參的鑒別,14.龜齡集；5.人參對照藥材； 6.人參皂苷rb1(s1)、re(s2)、rg1(s3),（四）萬氏牛黃清心丸中黃連的鑒別,15.萬氏牛黃清心丸； 6.黃連對照藥材；7.小檗堿,（五）華佗再造丸薄層色譜圖,（噴顯色劑前的）,（噴顯色劑后的）,1.12.吳茱萸對照藥材； 2.11.川芎對照藥材； 310.華佗再造丸,第五節(jié) 紫外-可見光譜鑒別法 (ultraviolet and visible spectroscopy),一、原理 某些中藥或中成藥經適當處

25、理后，所得紫外吸收光譜是由其各組分的特征吸收疊加而成的。若將中藥制劑作為一個特定的整體，在一定測試條件下，只要各藥味及其成分的組成與含量相對穩(wěn)定，則其紫外吸收光譜具有一定的特征性和重現(xiàn)性，可以用于定性鑒別。,兩組分的加和紫外吸收光譜,二、特點 分光光度鑒別法簡便、靈敏、易普及。 但由于紫外光譜分辨率較低，圖譜簡單，某些不同的樣品可能給出極其相似的光譜圖，使其在實際工作中受到一定的限制。如果對樣品進行前處理，除去干擾成分，則可有效地提高該法的專屬性。 中國藥典僅有少數(shù)中成藥品種收 載了分光光度鑒別法，例如，木 香檳榔丸等。 中國藥典規(guī)定以最大吸收波長 （max）做為鑒別參數(shù)。樣 品吸收峰波長應在

26、該品種項下 規(guī)定的波長2nm以內。,復方丹參片紫外譜線組圖,三、操作方法（p77 自學） 四、注意事項（p77 自學） 五、結果判斷 將供試品最大吸收波長和藥品標準的規(guī)定進行比較，二者如果一致，則判定為符合規(guī)定。,六、應用實例 木香檳榔丸 處方：木香、檳榔、枳殼、陳皮、青皮（醋炒）、香附（醋制 ）、三棱（醋制）、莪術（醋制） 取本品粉末4g，置蒸餾瓶中，加水10ml，使供試品濕潤后，水蒸汽蒸餾，收集餾液約100ml，照紫外分光光度法（中國藥典附錄v a）測定，在253nm波長處有最大吸收。（檢出揮發(fā)性成分）,第六節(jié) 氣相色譜鑒別法 (gas chromatography gc) 一、原理,在一定的色譜條件下，相同的物質應具有相同的色譜特性（分配系數(shù)）和色譜行為（保留值）。因此，在同一色譜條件下，將供試品溶液和對照品溶液分別注入氣相色譜儀，對二者的氣相色譜圖進行比對，根據(jù)供試品是否給出與對照品保留時間相同的色譜峰，從而對樣品作出定性分析。這種方法可稱為保留時間比較法，中國藥典即采用此法對某些中成藥進行真?zhèn)舞b別。保留時間（tr）系指從進樣開始，到該組分色譜峰頂點的時間間隔。,色譜峰示意圖,二、特點 氣相色譜法具有高分辨率，高靈敏度、快速、準確等特點，尤其適合分析制劑中的揮發(fā)性成分，如麝香酮、薄荷醇、冰片、水楊酸甲酯等。一般