1、四、轉(zhuǎn)座重組,由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。,大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。,插入序列(insertion sequences, IS)組成：,（一）插入序列轉(zhuǎn)座,二個分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列,特有的正向重復(fù)序列,一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因,插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：,保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition),復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition),In

2、tegration of IS element in chromosomal DNA,保守性轉(zhuǎn)座,復(fù)制性轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。,（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座子組成：,反向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因,IS10R is an autonomous element, while IS10L is non-autonomous,同源序列：是指從某一共同祖先經(jīng)趨異進(jìn)化而形成的不同序列。當(dāng)兩條序列同源時，它們的氨基酸或核苷酸序列通常有顯著的一致性（identity）。 同一物種不同個體間或不同物種間相同或相似的DNA序列。,

3、第二節(jié) 重組DNA技術(shù)又稱DNA克隆或分子克隆,DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,重組DNA技術(shù)的發(fā)展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。 1973年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。 1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。 1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。 1997年 英國羅林研究所成功的克隆了

4、多莉。 21世紀(jì) 越來越廣泛的應(yīng)用,轉(zhuǎn)基因植物,Frankenfood noun. Food derived from genetically modified (GM) plants and animals.,轉(zhuǎn)基因動物,轉(zhuǎn)基因動物,生物技術(shù)的應(yīng)用,Pharmaceuticals Agriculture Diagnostics,.uk/initiatives/Biomass/swed_deleg/Econova.htm,Energy Environmental Manufacturing,為什么要學(xué)習(xí)生物技術(shù),Because Biotech has alre

5、ady changed the world.,Because Biotech will continue to change the world.,Because a Biotech career will allow YOU to change YOUR world.,重組DNA技術(shù),基因工程，對攜帶遺傳信息的分子進(jìn)行設(shè)計和改造的工程，包括基因重組，克隆和表達(dá)。,一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念,克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。,獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。,（一） DNA克隆,技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA

6、 克?。?細(xì)胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮?應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆,Plasmid from a bacterium,DNA of interest from another organism,Clonable DNA fragment,Recombinant DNA,生物

7、技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等,基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。,基因工程的目的,目的： 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）,（二）工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶,重組DNA技術(shù)中常用的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease),限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別

8、位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。,+,Bam H,定義：,與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。,、（基因工程技術(shù)中常用型）,分類：,作用：,第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫； 第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶,類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱

9、同功異源酶。,+,Bam H,+,Bst,同功異源酶：,有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,限制性內(nèi)切核酸酶,（三）目的基因(target gene),基因組DNA (genomic DNA) 指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。 cDNA (complementary DNA) 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA

10、。,The synthesis of complementary DNA (cDNA) from a polyadenylated mRNA,（四）基因載體,定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。,常用載體 質(zhì)粒DNA 噬菌體DNA 病毒DNA,克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。,表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。,載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：,能自主復(fù)制； 具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；

11、有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源DNA。,質(zhì)粒 (plasmid),特點: 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。,噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克隆） EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）,噬菌體(phage)：寄生在細(xì)菌體內(nèi)的病毒,M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,The plasmid cloning vector pUC19,-galactosidase + X-gal (colorless) Blue color,I

12、nsertion of a piece of DNA into the plasmid cloning vector pUC19,+ X-gal white colony,Scheme for using phage DNA as a cloning vector,Cosmids 柯斯質(zhì)粒,Cosmids: 是人工的雜交分子包含噬菌體和質(zhì)粒序列，可以包裝成噬菌體顆粒 可以整合大的插入片斷 (up to 45 Kb) 不足之處: 重組的 cosmids 太小或太大（52 Kb）不能包裝成噬菌體顆粒。,Cosmid Cloning Vector,酵母人工染色體 (yeast artificial

13、chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）,其他,Bacterial Artificial Chromosome (BAC),可以克隆超過200 Kb的大片段 in E. coli 包含質(zhì)粒的復(fù)制起始子，多克隆位點及選擇標(biāo)記。F factor (keeps copy number at one per cell) 象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作。,Yeast Artificial Chromosome (YAC),可以在酵母中復(fù)制的線性載體 可以插入很大的

14、DNA片段 (up to 1 million bp),二、重組DNA技術(shù)基本原理,基本原理,以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程,（一）目的基因的獲取,化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 基因組DNA文庫(genomic DNA library) cDNA文庫(cDNA library) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) (見第22章),化學(xué)合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。,組織或細(xì)胞染色體DNA,基因片斷,克隆載體,重組DNA分子,含重組分子的轉(zhuǎn)化菌,限制性內(nèi)切酶,受體菌,基因

15、組DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合,從基因組DNA文庫獲取目的基因,用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫,從cDNA文庫獲取目的基因,用隨機(jī)切割的真核生物染色體cDNA片段構(gòu)建基因文庫,聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction (PCR),http:/users.ugent.be/avierstr/principles/pcrcopies.gif,Real -time PCR, (RT-PCR),（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建,目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。,（三）外源基因與載體的連接,方式：(1)

16、同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接 配伍末端連接 非配伍末端連接,粘性末端連接,Bam H切割反應(yīng),T4 DNA連接酶 15C,同一限制酶切位點連接,不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接,配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。,平端連接,限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端,適用于：,在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。,同聚物加尾連接,由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。,人工接頭(linker)連接,人工接頭及其應(yīng)用,The

17、cloning of cDNA using BamHI linkers,受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(competent),導(dǎo)入方式： 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection),（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌,1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等,（五）重組體的篩選,(插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇,互補(bǔ),利用互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18,原位雜交,Sout

18、hern印跡,Southern Blot Technique,Random primer method of radioactively labeling DNA,雞的肌球蛋白的克隆和檢出,免疫學(xué)方法,測序 （DNA Sequencing）,重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：,小結(jié),重組DNA技術(shù)操作的主要步驟,表達(dá)體系的建立： 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,（六）克隆基因的表達(dá),標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點 E.coli表達(dá)體系的不足： 不宜表達(dá)真核基因組DNA； 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)； 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ； 很難表達(dá)大量可溶性蛋白。,1. 原核表達(dá)體系 (E.coli表達(dá)體系最為常用),大鼠胰島素原cDNA 的表達(dá)和分泌,優(yōu)點：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟(jì),轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程,方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射,2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞）,表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜,第三節(jié) 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué) 的關(guān)系非常密切