1、第五章 抗原和抗體的制備與應(yīng)用,第一節(jié) 天然抗原的制備 第二節(jié) 人工抗原的制備 第三節(jié) 多克隆抗體的制備 第四節(jié) 抗體的純化和鑒定 第五節(jié) 單克隆抗體的制備,第一節(jié) 天然抗原的制備,一、顆粒天然抗原的制備 二、可溶性抗原的制備,一、顆粒天然抗原的制備,1.細(xì)菌抗原 2.血紅細(xì)胞抗原和組織細(xì)胞粗抗原的制備,1.細(xì)菌抗原(多用液體或固體培養(yǎng)物集菌后處理) 1)H抗原(鞭毛抗原，蛋白質(zhì)） : 用有毒力的菌株，菌液用0.30.5甲醛處理 2)O抗原（菌體抗原，細(xì)胞壁多糖抗原）: 需要100加溫2 2.5h后應(yīng)用。 3)Vi抗原（傷寒沙門菌的表面抗原，糖脂）：應(yīng)在殺菌后再加0.51氯化鈣溶液。 有些細(xì)胞

2、膜成分，如組織細(xì)胞膜、血細(xì)胞膜經(jīng)打碎后亦可制成顆?？乖ｎw?？乖瓚乙撼嗜闈釥?，多采用靜脈內(nèi)免疫法，較少使用佐劑作皮內(nèi)注射。,細(xì)菌菌體抗原的制備流程圖,液體培養(yǎng)或 斜面培養(yǎng)富集菌體 37 24h,100水浴 22.5h 殺菌,無菌試驗(yàn),NS稀釋成810億/ml,O菌體抗原,返回,4)菌苗,用細(xì)菌體制成的生物制品 a.活菌苗： 制備關(guān)鍵: 獲得減毒或無毒菌株，但應(yīng)保持免疫原性。 優(yōu)點(diǎn); 一般只需接種一次，且需量較小，但引起的 免疫效果好，能維持較長時間。 缺點(diǎn): 活菌苗需維持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏條 件，且有效期短。 實(shí)例：預(yù)防結(jié)核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。 b.死菌苗,b.死菌苗,制備關(guān)

3、鍵：用化學(xué)或物理方法將病原菌殺死后仍可保持免疫原性 特點(diǎn): 病原菌已被殺死，不能繁殖，用量較大，接種后可能出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等全身反應(yīng); 大多需多次接種。 實(shí)例：霍亂、傷寒、副傷寒甲、乙混合菌苗、百日咳菌苗等。,2.血紅細(xì)胞抗原和組織細(xì)胞粗抗原的制備 綿羊紅細(xì)胞抗原的制備 組織和細(xì)胞粗抗原的制備,綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖,搖動 15-20min,4,可保存3周,取適量,NS洗滌3次 2000r/min 10min,NS稀釋至 25%,抗凝血劑天然抗凝劑（肝素） Ca+2鰲合劑（檸檬酸鈉，氟化鉀）,有溶血現(xiàn)象應(yīng)棄去,2）組織和細(xì)胞粗抗原的制備 處理好的組織用生理鹽水洗去血跡及污染物。 將洗凈的組織

4、剪成小塊，進(jìn)行粉碎。 組織勻漿后通過20003000r/min離心10min后分成兩個部分 沉淀物含有大量的組織細(xì)胞和碎片-組織和細(xì)胞粗抗原； 上清液作為提取可溶性抗原的材料，提取前還要通過10002000r/min2030min的高速離心，以除去微小的細(xì)胞碎片，此時上清液應(yīng)澄清,來源: 組織和細(xì)胞，其成分比較復(fù)雜 1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備 2.蛋白質(zhì)抗原制備 3.核酸抗原制備 4.類脂多糖抗原制備 5.免疫球蛋白片段制備,二、可溶性抗原制備及鑒定,可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、 補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制備及鑒定,1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備程序,上

5、清液 澄清,所用材料必須是新鮮或低溫保存的,去除包膜或結(jié)締組織,臟器進(jìn)行灌洗,洗去血跡 及污物,NS內(nèi)含0.5gL NaN2,冷浴中組織剪碎,裝入搗碎機(jī)簡內(nèi)高速 粉碎制成組織勻漿液,3000rmin10min,取上清液,去除細(xì)胞碎片 及微小組織,離心,蛋白質(zhì)抗原制備,蛋白質(zhì)是良好的抗原，要制備特異性高 的抗血清通常需要純化?？刹捎茫?1.超速離心法 2.選擇性沉淀法 3.凝膠層析法 4.離子交換層析法 5.親合層析法,2.蛋白質(zhì)抗原制備（自學(xué)）,原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度 的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。,1)超速離心法,特點(diǎn)：用超速離心或

6、梯度密度離心法純化抗 原，極難將某一抗原成分分離出來。,應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕 的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球 蛋白、載脂蛋白A、B等。,2、選擇性沉淀法,原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用 各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原 成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。,2)、選擇性沉淀法,常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解 度不同）；常用3350飽和度的硫酸胺。,特點(diǎn)：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。,應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。,3凝膠層析法（凝膠過濾法）,原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)， 經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種 分子大

7、小不一的混合物加在凝膠床面時，大分 子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，在凝 膠顆粒之間的空隙中很快地通過凝膠床，短時 間內(nèi)被洗脫出來；而分子較小的物質(zhì)則進(jìn)入凝 膠網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，反復(fù)受到阻滯，洗脫較慢。分 成大、中、小三種類型。,3)凝膠層析法（凝膠過濾法）,原理：利用帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位 置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。,4)離子交換層析法,5親

8、和層析法（親和色譜）,原理：依據(jù)抗原抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行分離和提純的技術(shù)。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質(zhì)上，制成免疫吸附層析柱。當(dāng)樣品流過此柱時，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗IgG)結(jié)合；當(dāng)改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗脫下來，達(dá)到純化的目的。 優(yōu)點(diǎn)：提取純度高、抗原抗體不失活性。,5)親和層析法（親和色譜）,核酸抗原制備,大分子的核酸具有免疫原性。 提取核酸的主要步驟：,3.核酸抗原制備自學(xué),破碎細(xì)胞,核酸從細(xì)胞中游離出來,酸沉淀核酸,除去蛋白質(zhì),乙醇,酚和氯仿,類脂多糖抗原制備,苯酚法提取LPS：,干燥菌體或濕菌體,水中 混勻,激烈攪勻 加熱5mi

9、n,冰水 急冷,降至10以下,離心,上層的水層(含LPS) 下層的酚層 菌體殘?jiān)诘撞?吸取 水層,透析 除酚,加熱,超速離心,濃縮,LPS 在上層沉淀的透明膠狀部內(nèi),絞出,懸于水中,離心,得純化LPS,4.類脂多糖抗原制備自學(xué),同溫的苯酚,免疫球蛋白片段制備,1酶裂解法 酶對免疫球蛋白的水解有極好 的專一性，不同的酶可將免疫球蛋白裂解 為不同的片段。,5.免疫球蛋白片段制備,2氧化法和還原法 是將免疫球蛋白輕、重 鏈分開的兩種常用方法。,3. 還可用強(qiáng)變性劑或利用改變pH將免疫球蛋 白亞單位分開。,酶水解免疫球蛋白示意圖,Fc段，用以制備抗重鏈血清,F(ab)2，常作為抗體試劑用于試驗(yàn),木瓜

10、蛋白酶 （papain),胰蛋白酶 (pepsin),胃蛋白酶 (pepsin),1. 氧化法：優(yōu)點(diǎn)是切開后，肽鏈不能重新 形成二硫鍵、便于肽鏈純化； 缺點(diǎn)是色氨酸側(cè)鏈容易被破壞,氧化法和還原法,2. 還原法：將二硫鍵還原成巰基。但極不 穩(wěn)定，易重新形成二硫鍵，必須及時用 碘乙酸或碘化酰胺進(jìn)行羧甲基化,三、半抗原免疫原的制備,1.半抗原：低分子量的化學(xué)物質(zhì)。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、 某些藥物(包括抗生素）及其他化學(xué)物品等。,第二節(jié)、人工抗原的制備,2.載體：蛋白質(zhì)類 多肽聚合物 大分子聚合物,3.半抗原-載體連接方法:,載體類型,1.蛋白質(zhì)：人血清白蛋白、牛血清白蛋白

11、、兔 血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。,載體類型,2.多肽聚合物：人工合成的，常見的有多聚賴 氨酸，其分子量大（可達(dá)十幾萬到幾十萬)， 這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激免疫動 物產(chǎn)生高效價、高親和力的抗體。,3.大聚合物：羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可與半抗原結(jié)合，加入弗氏完全佐劑亦 可誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體。,通過電荷和微孔吸附手段,半抗原-載體連接方法1,碳化二亞胺法：,R-NH=CH-R,半抗原載體蛋白質(zhì),攪拌12h,室溫24h,透析除去未反應(yīng)的半抗原,人工免疫原,半抗原載體連接方法1,混合,帶游離的羧基或氨基的半抗原與載體連接,混合,半抗原-載體連接方法2,戊二醛法:,半抗原-NH2,載

12、體蛋白-NH2,半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-載體蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的帶有兩個活性基團(tuán)的雙功能聯(lián)接劑,半抗原載體連接方法2,與載體和半抗原的氨基相連接,半抗原-載體連接方法3,氯甲酸異丁脂法：,半抗原-COOH,載體蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-載體蛋白,半抗原載體連接方法3,簡便，用于類固醇抗原制備,HO-CH2CH(CH3)2,半抗原-載體連接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,帶羧基的半抗原琥

13、珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH,返回,吡啶,再經(jīng)氯甲酸異丁脂法或碳化 二亞胺法制備載體半抗原,半抗原載體連接方法4,第三節(jié) 多克隆抗體的制備,1.概念 2.多克隆抗體的特點(diǎn) 3.多克隆抗體的制備流程,一、 概念1.克?。簾o性繁殖細(xì)胞系，由單一個祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。2.多克隆抗體:用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機(jī)體多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。,二 、多克隆抗體的特點(diǎn),特點(diǎn): 不均一性 (抗體的異質(zhì)性

14、), 由外源性和內(nèi)源 性因素引起的 1) 外源性: 抗原分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 具有多種抗原 決 定簇, 每種決定簇引起一種相應(yīng)抗體的 產(chǎn)生. 反映了機(jī)體對抗原物質(zhì)的精細(xì)結(jié) 構(gòu)的識別能力. 2) 內(nèi)源性: 免疫球蛋白的血清型(回顧),免疫蛋白為大分子蛋白質(zhì)，具備抗原的各種性質(zhì)，對異種、同種異體，甚至宿主自身都是良好的抗原，且是一個抗原復(fù)合體，帶有多種抗原決定簇。Ig分子的這種異質(zhì)性反映了抗體形成細(xì)胞的遺傳性差異，代表抗體分子在不同水平上的遺傳變異性；通?？捎醚鍖W(xué)方法檢測出來，并據(jù)此將Ig及其肽鏈（H和L鏈）分成不同的血清學(xué)類型。 同種型 同種異型 獨(dú)特型,免疫球蛋白的血清型:,三、多克隆抗體的制備流

15、程,1.免疫動物的選擇 2.免疫的方法 3.動物采血法 4.免疫血清的分離與保存,一、免疫動物選擇,能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。 兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。,一、免疫動物選擇,1.抗原與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)越好；,2.動物必須適齡、健壯、無感染的正常動物、 體重合乎要求；,3.不同動物種類對同一免疫原有不同的免疫 應(yīng)答；,4.按需要量選擇大小不同的動物。,二、免疫方法,4.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐劑1月 抗原 混合免疫法：綜合皮下、淋巴結(jié)和靜脈,二、免疫方法,1.免疫原的注射劑量,2.免疫途徑：免疫反應(yīng)產(chǎn)生速度依次為靜脈 腹腔肌肉

16、皮下皮內(nèi)淋巴結(jié)足掌 3. 免疫時間間隔：首次和第二次之間10-20天為宜，第二次以后 7-10天。免疫次數(shù)3-5次。,三、動物采血法,1.頸動脈放血法：最常用的方法-常用于家兔的全采血 2.心臟采血法：要求操作熟練-常用于家兔和豚鼠的采血。 3.靜脈采血法：頸靜脈采血常用于綿羊；耳靜脈采血常用于 家兔；尾靜脈采血常用于小白鼠和大白鼠。,1.4保存：可保存36個月 2.低溫保存：-20-40，可保存23年 3.冰凍干燥保存：可保存35年,三、動物采血法,四、免疫血清的分離和保存,第四節(jié) 抗體的純化和鑒定,1.抗體特異性的純化 2.特異性IgG類抗體的純化 3.特異性抗體的鑒定,一、抗體特異性的純

17、化,1.親合層析法：將交叉抗原交聯(lián)到Sepharose 4B上，裝柱后，將預(yù)吸收的抗體通過親合層 析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液則是特異 性抗體。,一、抗體特異性的純化,2.吸附法：利用不含特異性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原則與抗體結(jié)合，上 清液則為無雜抗體的單價特異性抗體。,二、特異性IgG類抗體的純化,1.鹽吸沉淀法：經(jīng)硫酸銨鹽吸提取球蛋白 3次，基本為IgG類抗體，但不純。,二、特異性IgG類抗體的純化,2.A蛋白親和層析：SPA與IgG的Fc段有很強(qiáng)的 特異性的親和力，細(xì)菌表面不同位點(diǎn)獨(dú)立地 與抗體結(jié)合，一個A蛋白至少可以結(jié)合二個 IgG分子。適合純化細(xì)胞培養(yǎng)上清中的McA

18、b。,3.其它：凝膠過濾、離子交換層析等,5.單抗的優(yōu)缺點(diǎn),第五節(jié) 單克隆抗體的制備,1975年分子生物學(xué)家G.J.F.keler和C. Milstein在細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，把體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個細(xì)胞培養(yǎng)，可形成單細(xì)胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高滴度的、非常均一的抗體,單克隆抗體:由一個識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價高,少或無交叉反應(yīng)性。

19、,Niels K. Jerne,G. Kohler,C. Milstein,單克隆抗體,高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個識別單一抗原表位的B細(xì)胞克隆所分泌。一般來自雜交瘤細(xì)胞,雜交瘤技術(shù)的基本原理,單克隆抗體制備步驟,1.致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 2.骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 3.飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備 4.細(xì)胞融合 5.選擇性培養(yǎng) 6.特異性抗體的檢測 7.雜交瘤細(xì)胞的克隆化 8雜交瘤的凍存和復(fù)蘇 9單克隆抗體的大量制取 10單克隆抗體的純化,步驟1 致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備,完全抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì) 半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于5000 Da 物質(zhì) 半抗

20、原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價的抗體,步驟1 致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備,動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài) 抗原免疫：方式體內(nèi)、體外 劑量0.5-100g 次數(shù)視抗原而定 間隔視抗原而定 佐劑視抗原而定 收集時間：末次加強(qiáng)免疫（iV或iP）后72-96h,BALB/C小鼠,選擇體重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制備抗原免疫。,步驟2 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,常用骨髓瘤細(xì)胞系：SP20、NS1、P3.653 融合時骨髓瘤細(xì)胞的選擇： a.處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95 b.細(xì)胞株保持HGPRT 缺陷狀態(tài)（次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移）,步驟3

21、 飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備,常用飼養(yǎng)細(xì)胞：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞，小鼠或大鼠胸腺細(xì)胞等。 飼養(yǎng)細(xì)胞主要作用：可能在培養(yǎng)液中釋放某種生長刺激因子；滿足新生細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性；減少聚苯乙烯培養(yǎng)板孔對新生細(xì)胞的毒性等,步驟4 細(xì)胞融合,步驟5 選擇性培養(yǎng),HAT選擇培養(yǎng)原理 隨機(jī)融合后的細(xì)胞類型,選擇性培養(yǎng)原理：,核苷酸主要合成途徑,核苷酸補(bǔ)救合成途徑,氨基碟呤 （A）,次黃嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,核苷酸,DNA,步驟6 特異性抗體的檢測,對檢測方法的要求： 靈敏度高 特異性強(qiáng) 簡便快速 常用檢測方法：ELISA,陽性孔的檢測,步驟7. 雜交瘤細(xì)胞的克隆化,目的：建立單一細(xì)胞克隆 方法：有限稀釋法，顯微操作法，軟瓊脂培養(yǎng)法 克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔,有限稀釋法,計(jì)數(shù),0.5-2/孔,步驟8雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,凍存：慢凍，分步凍存， 室溫-20-70液氮 復(fù)蘇：