1、,Antitumor effects of a novel benzonaphthofurandione derivative (8e) on the human colon cancer cells in vitro and in vivo through cell cycle arrest accompanied with the modulation of EGFR and mTOR signaling,一種新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物（8e）通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)和調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號發(fā)送從而誘導(dǎo)細胞周期停滯進而對體外和體內(nèi)的人結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生抗癌作用,細胞生

2、物學20th 宋繼達&郭羽,論文信息,1.文章所刊登的學術(shù)雜志：Chemico-Biological Interactions (化學與生物相互作用) 發(fā)表時間：2011年5月3日 2.文章作者： 韓國首爾國立大學藥學院 Hwa-Jin Chung， Sang Kook Lee 韓國首爾梨花女子大學藥學院 Hee-Kyung Rhee，Hea-Young Park Choo 3.關(guān)鍵詞： 苯并呋喃并萘二酮衍生物 (Benzonaphthofurandione derivative) 癌細胞 HCL116 抗癌活性 (Antitumor activity) G0/G1期的細胞周期停滯 (G0/G

3、1 cell cycle arrest) 表皮生長因子受體/雷帕霉素靶蛋白信號發(fā)送 (EGFR/mTOR signaling),ppt結(jié)構(gòu),1.Introduction,2.Methods and results,3.Discussions,主要實驗流程,1.測定對比8e和阿霉素對癌細胞的增殖抑制效力（以半抑制濃度表示），并用倒置相差顯微鏡觀察癌細胞前后形態(tài),2.用不同濃度的8e處理癌細胞24h和48h，并用流式細胞術(shù)分析癌細胞的細胞周期分布,4.提取第2步得到的癌細胞中與細胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白，并用Western blot技術(shù)分析這些蛋白質(zhì)的表達水平，以推測8e的抑癌機理,3.將癌細胞

4、移植到無胸腺小鼠身上使其長成腫瘤，分析8e和阿霉素對腫瘤生長的抑制效果，并對腫瘤組織進行免疫組化分析,1.Introduction,背景：結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)的頭號癌癥殺手之一，每年有大約一百萬的新增病例。盡管全球結(jié)腸癌的發(fā)病率在逐步下降，但近年來由于飲食習慣的西化，亞洲國家結(jié)腸癌患者數(shù)目顯著上升。因此仍有必要開發(fā)新型的抗結(jié)腸癌藥物。 阿霉素(Doxorubicin) ，一種蒽環(huán)類化合物，是臨床上用來作為治療癌癥的藥物。 下面我們來看看8e和阿霉素(Doxorubicin)的化學結(jié)構(gòu)式。,8e的結(jié)構(gòu)式,阿霉素(Doxorubicin),【作用與用途】阿霉素是一種廣譜抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和

5、DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，對多種腫瘤均有作用，屬非周期特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。但有一定的毒副作用。 【毒性反應(yīng)】白細胞和血小板減少，約60%80%的病人可發(fā)生；100%的病人有不同程度的毛發(fā)脫落，停藥后可以恢復(fù)生長；心臟毒性，表現(xiàn)為心律失常， ST-T改變(ST和T 分別指兩種心電波)、惡心、食欲減退；藥物溢出血管外可引起組織潰瘍及壞死。另外，用藥后尿液可出現(xiàn)紅色。,2.Methods and results,2.1化學試劑（Chemicals）（略） 2.2合成8e （Synthesis of compound 8e）：按已發(fā)表的文獻提供的化學合成方法人

6、工合成。 2.3癌細胞的培養(yǎng)（Cell culture）：人結(jié)腸癌細胞HCL116由美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）提供，用加富的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基另外加入了10%熱滅活的胎牛血清（FBS），100單位/mL青霉素（盤尼西林），100ug/mL鏈霉素，250ng/mL兩性霉素B。置于含5% CO2的控濕氛圍中培養(yǎng)。,2.4 8e和阿霉素對癌細胞抑制效力的測定：,癌細胞HCL116(以1104 個/mL的密度植于96孔盤)分別加入不同濃度的8e或阿霉素(Doxorubicin)后置于37含5%CO2的控濕氛圍中培養(yǎng)72h。經(jīng)其他步驟處理后用570nm波長測量吸光度以求得存活細胞

7、的數(shù)量，并用非線性回歸分析的方法計算8e和阿霉素對癌細胞的半抑制濃度（IC50）。,8e和阿霉素對癌細胞的半抑制濃度,，,結(jié)果,計算結(jié)果表明阿霉素對癌細胞的半抑制濃度為46.2 nm /L，而8e對癌細胞的半抑制濃度為52.9nm/L，8e的抑癌效力稍遜于阿霉素。 用8e處理癌細胞24h和48h后用倒置相差顯微鏡觀察癌細胞的形態(tài)。雖然癌細胞存活的數(shù)量隨8e濃度增大而遞減，但實驗組的癌細胞與對照組相比并沒有明顯的形態(tài)學變化。,倒置相差顯微鏡對8e處理后癌細胞的觀察結(jié)果,8e處理后癌細胞變得稀疏，但沒有明顯的形態(tài)學變化。,2.5 8e對癌細胞細胞周期分布的影響,用磷酸鹽緩沖液配制25、50、75n

8、m/L的8e溶液為實驗組，并以磷酸緩沖液為空白對照，分別處理癌細胞，在24h和48h后用流式細胞儀分析癌細胞的細胞周期分布。,流式細胞術(shù)分析細胞周期分布的結(jié)果,結(jié)果表明細胞周期停滯在G0/G1時期與8e的濃度有關(guān),2.6蛋白質(zhì)印跡分析,將經(jīng)過25、50、75nm/L的8e處理24和48小時后的癌細胞的總蛋白質(zhì)提取出來后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯薄膜上，薄膜用特制的緩沖液在室溫下處理1h，接著用以磷酸鹽緩沖液稀釋的特異性抗體進一步在4下過夜處理。然后用特制的緩沖液洗滌后，薄膜在室溫下用二抗標記的辣根過氧化物酶繼續(xù)處理2h，然后用熒光影像分析儀配合辣根過氧化

9、物酶熒光檢測試劑盒來顯像。,蛋白質(zhì)免疫印跡分析圖譜,蛋白質(zhì)免疫印跡分析圖譜,2.7小鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制實驗,實驗采用6星期大的雄性無胸腺小鼠(athymic mice)。 在第0天將HCL116癌細胞懸液皮下注射到每只小鼠的右側(cè)腹部，當腫瘤體積長到9095mm3時（約在接種后第7天）開始用8e或阿霉素對小鼠進行治療。 實驗之前小鼠被隨機分為6組（5個實驗組和1個對照組），每組6只。 5個實驗組： 阿霉素3mg/kg/day, 8e 2mg/kg/day , 8e 5mg/kg/day , 8e 10mg/kg/day , 8e (5mg/kg/day)阿霉素(3mg/kg/day) 8e和阿霉

10、素分別溶于磷酸鹽緩沖液并設(shè)置1個只有溶劑的空白對照。5組藥物都是以腹膜內(nèi)注射的方式給藥，每周3次，持續(xù)3周，每組共給藥9次。,小鼠體重和腫瘤體積的變化,自接種癌細胞當天起，于第0、9、18、24、28天對小鼠進行體重稱量和腫瘤體積的測量。（在第28天實驗結(jié)束可以將小鼠身上的腫瘤摘取下來通過液體推排法測量腫瘤的體積，但由于實驗過程中在不能摘取腫瘤的情況下也要測量腫瘤的體積，因此本實驗中腫瘤體積的測量是通過較為精準地測量腫瘤的長寬高，然后用公式（體積=長 寬高 / 6）計算出來的。不同時期的小鼠體重以柱狀圖表示，腫瘤體積以折線圖表示。,小鼠與摘取下來的腫瘤,小鼠體重的變化,腫瘤體積的變化,與對照相

11、比的腫瘤抑制率,對腫瘤組織進行免疫組化分析,用抗Ki-67抗體對腫瘤組織進行免疫組化分析以檢測癌細胞的增殖情況。Ki-67是一種與細胞周期相關(guān)的增殖細胞核抗原（PCNA）。Ki-67是目前多種惡性腫瘤尤其是乳腺癌研究中的熱門生物標志物，可以通過對Ki-67的檢測了解惡性腫瘤的細胞增殖活性。,腫瘤的免疫組化分析結(jié)果,分析結(jié)果表明8e抑制了增殖細胞核抗原Ki-67的表達。,小鼠治療實驗的結(jié)論,經(jīng)過3周的藥物治療之后，10mg/kg/day的那個實驗組與對照組相比，腫瘤的抑制達到58.7%。與對照組相比，實驗組小鼠沒有觀察到明顯的體重變化和副作用。同時，免疫組織學分析表明，在異種移植的癌細胞中，8e

12、抑制了增殖生物標志物Ki-67的表達，表明8e的確有效地抑制了癌細胞在體內(nèi)的增殖。,3.Discussion（重點）,在最初的研究中作者發(fā)現(xiàn)8e對多種人類癌細胞系都有生長抑制作用，而在固態(tài)腫瘤（實體腫瘤）中人結(jié)腸癌細胞HCL116的生長對8e的抑制活性尤為敏感。因此他們設(shè)計實驗，從細胞周期調(diào)控蛋白的表達和細胞信號傳導(dǎo)途徑兩個方面進一步研究8e對人結(jié)腸癌細胞的作用機理。,cyclin與CDK的功能： 一般認為細胞周期蛋白（cyclins）和周期蛋白依賴性激酶(CDKs)是細胞周期的的調(diào)控者并通過相互結(jié)合形成cyclin-CDK復(fù)合物來起作用。在細胞周期的不同時期，不同的cyclin-CDK復(fù)合物

13、通過使特異的轉(zhuǎn)錄因子或其他蛋白質(zhì)的磷酸化，開啟或關(guān)閉某些基因的表達，或直接調(diào)節(jié)某些蛋白質(zhì)的活性，從而推動細胞周期的更替。但是癌細胞的細胞周期調(diào)控蛋白失控并導(dǎo)致細胞的異常增殖。,Part 1,細胞周期的一般模式,G1/S檢控點,CDK4 、CDK6與cyclinD形成的復(fù)合物主要在G1期起作用，促進G1/S轉(zhuǎn)變,CDK2 與cyclinE形成的復(fù)合物作用于S期的起始階段,CDK2與 cyclinA形成的復(fù)合物的作用貫穿于整個S期,CDK1與cyclinA或cyclinB（主要是cyclinB )形成的復(fù)合物則在G2/M轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用,G1/S轉(zhuǎn)變的調(diào)控機理,在細胞周期G1/S轉(zhuǎn)變過程中，首先由c

14、yclinD（D1、D2、D3）與CDK4和CDK6結(jié)合形成cyclinD-CDK復(fù)合物，然后進入細胞核內(nèi)， CDK的某些位點被CAK（周期蛋白依賴性激酶活性激酶）磷酸化。磷化后具有激酶活性的cyclinD-CDK復(fù)合物使pRb-E2F復(fù)合物（E2F是一種轉(zhuǎn)錄活化因子）中的pRb（視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白，一種細胞周期抑制蛋白）磷酸化為p-pRb， 但pRb上有多個可磷酸化的位點，僅僅靠cyclinD-CDK對其進行磷酸化是不夠的，隨后還需要cyclinE-CDK2繼續(xù)對pRb上的其他位點進行磷酸化，以及cyclinA/B依賴性激酶的活化來維持p-pRb的高度磷酸化狀態(tài)。 p-pRb不具有與E2F結(jié)

15、合的活性，因而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F。被釋放的E2F進入核內(nèi)結(jié)合一系列的基因啟動區(qū)（c-myc、b-myb、cdc2等）促進這些基因的轉(zhuǎn)錄，使細胞通過G1/S檢控點，從G1期進入到S期。,簡意圖,促分裂信號,CyclinD水平升高,CDK2,CDK4,cyclinD-CDK2,cyclinD-CDK4,pRb-E2F,p-pRb,pRb 磷酸化,E2F,活化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,細胞通過G1/S檢控點，從G1期轉(zhuǎn)變到S期,cyclinE-CDK2,繼續(xù)磷酸化,cyclinA/B-CDK,維持高度磷酸化 不再結(jié)合E2F,進入 核內(nèi),增殖細胞核抗原 PCNA,PCNA是一種由三個相同亞基組成的，總相對分子質(zhì)

16、量為29kD的環(huán)狀同源三聚體蛋白，在細胞核內(nèi)合成并分布于細胞核內(nèi)，是真核生物DNA聚合酶的輔助蛋白。 PCNA的三聚體環(huán)形結(jié)構(gòu)環(huán)繞著雙鏈DNA，起到滑動發(fā)夾的作用，相當于原核生物DNA聚合酶的亞基，極大地增強了真核生物DNA聚合酶的持續(xù)合成能力，而且PCNA也參與DNA的損傷修復(fù)。,P21的抑制作用,P21：一種細胞周期抑制蛋白 p21可以與cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合從而抑制CDK的激酶活性，進而使pRb不能維持磷酸化狀態(tài)，而且cyclin-CDK的其他一些生物學活性也不能實現(xiàn)。最終將無法轉(zhuǎn)錄一系列與細胞周期時相轉(zhuǎn)變（如從G1期轉(zhuǎn)變?yōu)镾期）相關(guān)的基因，從而導(dǎo)致細胞周期停滯。 P21與PCN

17、A結(jié)合可以抑制PCNA與雙鏈DNA的連接，從而抑制DNA的復(fù)制過程。,8e對細胞周期調(diào)控蛋白表達水平的影響,如蛋白質(zhì)印跡圖譜所示， （1）表達水平上調(diào)的因子有：細胞周期抑制蛋白p21； （2）表達水平下調(diào)的因子有： cyclin D1、 cyclin A、 cyclin E 、CDK2 、CDK4、 c-Myc 蛋白（原癌基因c-Myc的表達產(chǎn)物）、 pRb（視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白，是一種細胞周期抑制蛋白） 、 p-pRb（磷酸化的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白）、 PCNA（增殖細胞核抗原） 結(jié)論：8e介導(dǎo)的G0/G1期的細胞周期停滯與周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p21的上調(diào)和CDK2 、CDK4、 cycl

18、in D1、cyclin A and cyclin E 的下調(diào)有關(guān)。,Part 2 名詞解釋1,1.表皮生長因子受體（EGFR）：一種可被胞外促有絲分裂因子（包括表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子 、雙調(diào)蛋白和乙胞素）所激活的典型的酪氨酸蛋白激酶受體（RTK，245頁）。很多癌細胞，包括結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌等癌細胞都有EGFR過分表達的現(xiàn)象。,2.雷帕霉素靶蛋白（mTOR）：廣泛存在與各種細胞中，在細胞增殖、遷移、分化和生存中發(fā)揮重要作用，而且也是Akt（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）促進細胞生存和抑制細胞凋亡的下游靶標。同時mTOR也通過激活激酶P70S6K和抑制翻譯起始因子eIF4E

19、的抑制物4E-BP1來參與許多生存蛋白的起始翻譯。,名詞解釋2,PIK3：磷脂酰肌醇3激酶（254頁），也就是磷脂酶C（PLC，237頁），可以將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2，238頁）水解為二脂酰甘油（DAG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。 Akt：又稱PKB（蛋白激酶B），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用。 PI3K-Akt信號途徑是一條經(jīng)典的信號途徑。 ERK：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的三大亞族之一，是哺乳類動物中了解的最為清楚的MAPK亞族，其信號傳遞通路為典型的MAPKKK/MAPKK/MAPK三級酶促級聯(lián)反應(yīng)

20、，是調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育以及分化的信號網(wǎng)絡(luò)的核心。,名詞解釋3,c-Src ：是一種非受體酪氨酸蛋白激酶（即胞質(zhì)酪氨酸蛋白激酶），其活化機制與受體酪氨酸蛋白激酶（RTKs）相似，同樣需要自身磷酸化和受體二聚化。 mTOR： 雷帕霉素靶蛋白， 通過與多種蛋 白結(jié)合成2種復(fù)合物 mTORC1和mTORC2 發(fā)揮其生理功能。 STAT ：信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子，可被特定的酪氨酸激酶（如c-Src ）磷酸化為p-STAT，p-STAT發(fā)生聚合形成同源或異源二聚體活化態(tài)，進入核內(nèi)與靶基因啟動子序列的特定位點結(jié)合,促進其轉(zhuǎn)錄。已成功克隆4種JAK(JAK13和Tyk2)與7種STAT(STAT1，STAT2

21、，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6)。,EGFR激活后有3條胞質(zhì)信號通路： MAPK通路 PIK3通路 c-Src通路 真核細胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的激活mTOR的信號通路： PI3K / AKT / mTOR Ras /MAPK /mTOR AMPK /mTOR （ AMPK 是腺苷酸活化蛋白激酶） 氧氣 / mTOR 氨基酸 / mTOR,構(gòu)成EGFR/mTOR信號通路,1,2,3,TSC1 /2和Rheb是連接Akt和復(fù)合物mTOR1 的兩個因子,PI3K / AKT / mTOR信號通路,mTOR通過與多種蛋白結(jié)合形成兩種復(fù)合物mTORC1和mTORC2發(fā)揮生理功能,mTOR很重要的一條下游通路就是調(diào)控蛋白質(zhì)的合成： 在mTORC1的靶蛋白中， 4E-BP1（真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白 ）和p70S6K （ 核糖體蛋白S6激酶，254頁）在控制蛋白質(zhì)的合成方面起到重要作用。 而mTORC1磷酸化4E-BP1和p70S6K 。 4E-BP1發(fā)生磷酸化后使elF4E（真