1、Chapter 16色層分離法Chromatography,概述 色譜分離中的概念及其分類 色層分離法介紹（8 種方法） 總結(jié),16.1 概述,16.1.1 色譜法的起源,1創(chuàng)立：1906年，俄國植物學(xué)家Tsweet 植物色素分離見圖示 2現(xiàn)狀：一種重要的分離、分析技術(shù) 分離混合物各組分并加以分析，還可以進行制備 固定相除了固體，還可以是液體 流動相液體或氣體 色譜柱各種材質(zhì)和尺寸 被分離組分不再僅局限于有色物質(zhì),碳酸鈣 （固定相）,色素混合液,石油醚 (流動相）,1906年，Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象,色譜柱,16.1.1 色譜法的起源,植物色素分離圖示,16.1.2 色譜法的發(fā)展,1、歷

2、史 30年代 茨維特分離綠葉色素，產(chǎn)生固液吸附色譜 40年代 液液分配色譜法 、TLC、紙色譜 50年代 GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能 60年代 推出了色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 70年代 HPLC出現(xiàn)使色譜分析范圍進一步擴大 80年代 出現(xiàn)了超臨界流體色譜法、毛細管電泳法 90年代 崛起的電色譜法，兼有毛細管電泳法與微 微填充柱色譜法的優(yōu)點 21世紀(jì) 色譜科學(xué)將在生命科學(xué)等的前沿發(fā)揮他不可替代的重要作用,16.1.3 色譜法的用途,用途：色譜法已廣泛用于各個領(lǐng)域，是多組分混合物首選的分離分析方法。以中國藥典2005版為例，一部收載中藥1146個品種，用薄層色譜進行鑒別或含量測定的

3、有1523項，用高效液相色譜進行定量分析的有479種518項，用氣相色譜進行檢測的有47種。二部收載的有1967個品種，采用高效液相色譜法的品種有848種?，F(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學(xué)。,第二節(jié) 色譜分離中的概念及其分類,16.2.1 概念 色譜分離法又稱層析分離法：即是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小，分子的極性，吸附力，分子的親和力，分子的分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相是固定的，稱固定相；另一相是流動的，稱流動相。當(dāng)流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達到分離。,16.2.2色層分離法分類,1）按兩相分子的聚集狀態(tài)分類,流動相 固

4、定相 類型,超臨界流體色譜法流動相為超臨界流體,2）按固定相的固定方式分類,3）按分離機制分類,吸附色層分離法 離子交換色層分離法 凝膠過濾色層分離法 疏水作用色層分離法 親和色層分離法,16.2.2色層分離法分類,16.2.3展望,新型固定相和檢測器 手性固定相、浸透限制性固定相、灌注色譜固定相、生物色譜固定相等；蒸發(fā)光散射檢測器 色譜新方法的研究 超臨界流體色譜法、毛細管電泳法、毛細管電色譜法 色譜聯(lián)用技術(shù) GC-MS/MS、LC-MS/MS 色譜專家系統(tǒng) 是一種色譜計算機聯(lián)用技術(shù),16.2.4 色譜系統(tǒng)的基本組成,酶活性,酶試劑,分析法,洗脫分析法:洗脫劑對固定相沒有親和力 前流分析法：

5、吸附最弱的組分最先流出來 頂替分析法：利用一種吸附力比各吸附組分都強的物質(zhì)來洗脫,16.2.5色譜分離的有關(guān)術(shù)語,分配系數(shù) 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系數(shù) q、c-溶質(zhì)在固相和流動相中的濃度,阻滯因子Rf 阻滯因子是在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的遷移速度和一個理想標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的遷移速度之比。 其意義在于體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小,16.2.5色譜分離的有關(guān)術(shù)語,溶出體積 色譜柱中，使溶質(zhì)的最大濃度區(qū)從柱中流出時已流出流動相體積， Vs：色譜柱中固定相的體積； Vm：色譜柱中流動相的體積 不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異,R,16.2.5色譜分離的有關(guān)術(shù)語,保

6、留時間（tR）和溶出體積（VR） 反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。,死體積,16.2.5色譜分離的有關(guān)術(shù)語,Martin和Syng最早提出塔板理論，將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入色譜柱后，就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作一個理論塔板，一個理論塔板的長度稱為理論塔板高度H。經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。由于色譜柱內(nèi)的塔板數(shù)相當(dāng)多，因此即使組分分配系數(shù)

7、只有微小差異，仍然可以獲得好的分離效果。,色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度,16.2.5色譜分離的有關(guān)術(shù)語,理論塔板數(shù)的計算方法： N-理論塔板數(shù) tR-保留時間 W1/2-半峰寬 Wb-峰底寬度 理論塔板高度：L-柱長,16.2.5色譜分離的有關(guān)術(shù)語,第三節(jié) 色層分離法介紹,主要包括,16.3.1 吸附色譜法 16.3.2 疏水作用色層分離法 16.3.3 金屬螯合層析 16.3.4 共價作用色層分離法 16.3.5 色層分離法 16.3.6 離子交換層析 16.3.7 色層分離法 16.3.8 親和層析,16.3.1吸附色譜法,原理:利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力 (范德華力，包括色散力、誘

8、導(dǎo)力、定向力以及氫鍵)的差異而實現(xiàn)分離。 利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對不同溶質(zhì)吸附能力的強弱進行分離的方法，稱之為吸附層析。,Adsorption chromatography,當(dāng)溶液中某組分的分子在運動中碰到一個固體表面時，分子會貼在固定表面上，這就發(fā)生了吸附作用。,常用的吸附劑： 無機吸附劑:磷酸鈣、二氧化鈦、氫氧化鋅、氧化鈣凝膠、膨潤土、氧化鋁、硅膠、活性炭、硅藻土 有機吸附劑:纖維素、聚酰胺,16.3.1吸附色譜法,16.3.2疏水作用色層分離法(Hydrophobic Interaction Chromatography）,Hyd

9、rophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity.,1）疏水作用色層分離法：利用固定相載體（瓊脂糖）上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離的方法。,方法：在層析劑（多孔親水性）基質(zhì)與起吸附作用的功能團之間接上一段直鏈碳鏈（稱接枝手臂），能顯著提高分離效果。,原因：接枝手臂的直碳鏈本身與蛋白質(zhì)表面某一 對應(yīng)疏水區(qū)域相互作用（疏水效應(yīng)），增 強了對蛋白質(zhì)

10、的吸附能力和分辨能力。,16.3.2疏水作用色層分離法,Mechanism of HIC,用碳鏈長度依次變化的同系列的烷基瓊脂糖SephCn(n=1-6)分別裝柱，在相同條下將混合蛋白 質(zhì)溶液通入柱中，不同蛋白質(zhì)將在烷基瓊脂系列柱 中顯示不同吸附特性，蛋白質(zhì)的分辨能力取決于碳 鏈的長度，因此可利用系列柱實驗來調(diào)節(jié)己知蛋白 質(zhì)的吸附強弱，然后用緩沖液進行洗脫。,3).應(yīng)用：,互換酶的分離 蛋白質(zhì)亞基與蛋白質(zhì)聚合物的分離 多肽與蛋白碎片的分離 完整細胞進行選擇性吸附,2）.操作過程,16.3.2疏水作用色層分離法,生物分子表面大都有或強或弱的疏水區(qū)域，在不同環(huán)境下，與各種疏水介質(zhì)產(chǎn)生不同強弱的結(jié)合

11、，高離子強度可加強疏水性。 跟離子交換相反，高鹽吸附，低鹽洗脫；洗脫樣品又可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱，作為連接層析步驟的橋梁 無須有機溶劑洗脫，保存生物活性 配體種類繁多，很難預(yù)測哪一種、哪一個條件最適合，可用疏水層析試盒選擇介質(zhì),4).疏水作用色層特點,16.3.2疏水作用色層分離法,疏水介質(zhì)選擇,16.3.3金屬螯合層析 (Metal Chelating Chromatography),金屬螯合層析：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸，組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生螯合作用進行分離的方法。,金屬螯合層析技

12、術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于表達蛋白的分離,16.3.3金屬螯合層析,16.3.3金屬螯合層析,和傳統(tǒng)的親和層析相比，固定化金屬離子親和層析具有以下優(yōu)點： (1)配基穩(wěn)定性高，不易脫落； (2)金屬離子配基價格低廉，再生成本低； (3)可在高鹽濃度下 操作，從而省去了脫鹽的預(yù)處理步驟，而且可以減少非特異性吸附； (4)蛋白質(zhì)洗 脫比較容易，采用較低pH或采用競爭性物質(zhì)如咪唑，EDTA，便可將吸附蛋白解吸下來 。,16.3.3金屬螯合層析,16.3.4共價作用色層分離法(Covalent chromatography),利用溶質(zhì)分子與層析劑凝膠之間的共價吸附作用將目的產(chǎn)物與其他溶質(zhì)分離的一種層析方法

13、。,原理：利用二硫鍵（-S-S-)和（-SH)基相互作用,谷胱甘型二硫鍵層析劑 巰基丙基型二硫鍵層析劑,分離過程：,吸附：,洗脫：,再生：,應(yīng)用：分離半胱氨酸、分離含半胱氨酸（-SH)的肽段、分 離含-SH基的蛋白質(zhì)或進一步分離該蛋白質(zhì)中-SH基附近的肽段。,巰基化合物,16.3.5 聚焦色層分離法(Focusing chromatography),基于離子交換的原理，根據(jù)兩性電解質(zhì)分子間等電點的差別進行分離純化的洗脫層析法。,當(dāng)向?qū)游鲋鶅?nèi)通入與柱內(nèi)初始pH值不同的多緩沖劑時，柱內(nèi)pH值緩慢改變，在軸向形成連續(xù)的pH梯度，使料液中的溶質(zhì)依據(jù)各自的等電點或者吸附或者脫附逐次向下移動，彼此之間得到

14、分離。,利用固定相球形介質(zhì)表面活性基團經(jīng)化學(xué)鍵合方法，將具有交換能力的離子基團在固定相上面，這些離子基團可以與流動相中離子發(fā)生可逆性離子交換反應(yīng)而進行分離的方法，稱之為離子交換層析。,16.3.6離子交換層析(ion exchange chromatography),16.3.7排阻層析 （凝膠層析）Gel chromatography,凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異進行層析分離的方法，均稱之為排阻層析。用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥在研究和生產(chǎn)中必不可少的分

15、離介質(zhì)。,16.3.7.1凝膠過濾色層分離法,凝膠層析是生物化學(xué)中一種常用的分離手段，它具有設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點，因此廣泛用于蛋白質(zhì)(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。,16.3.7.2原理,凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨

16、流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出。,16.3.7.2凝膠層析的原理,凝膠裝置圖,色譜峰和分離結(jié)果,16.3.7.3凝膠,（一）凝膠的種類和性質(zhì) 1）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 由葡聚糖和3-氯-1.2-環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵相互交聯(lián)而形成具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。 Sephadex G 系列 G值表示每克干膠吸水量（mL）的十倍。 G 反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。,葡聚糖凝膠(Sephadex )的物理特性,2）瓊脂糖凝膠（Sepharose),瓊脂

17、糖的商品名稱有Sepharose (瑞典)、Bio-gel A(美國)、Segavac(英國)、Gelarose(丹麥) 。 瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6位脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，在溫度100時呈液態(tài)，當(dāng)下降至45以下時，它們之間相互連接成線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖；再凝聚即呈瓊脂糖凝膠。 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 瓊脂糖凝膠按其濃度不同，分為Sepharose 2B(濃度為2)、4B(濃度為4)及6B(濃度為6)。,16.3.7.3凝膠,3）聚丙烯酰胺（Bio-Gel P),一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越

18、多，孔隙度越小。該凝膠多制成干性珠狀顆粒劑型，使用前必須溶脹。聚丙烯酰胺凝膠層析對蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定、核苷及核苷酸的分離純化，均能獲得理想的結(jié)果。,16.3.7.3凝膠,16.3.7.4使用過程方法及注意事項,1)、凝膠的選擇,一般來講，選擇凝膠首先要根據(jù)樣品的情況確定一個合適的分離范圍，根據(jù)分離范圍選擇合適型號的凝膠。例如蛋白脫鹽常采取分離范圍較小的Sephadex G-10或G-15。 選擇凝膠的另一個方面就是凝膠的顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對流速慢，實驗時間長，有時會造成擴散現(xiàn)象嚴(yán)重；顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。,2)、凝膠的處理,凝膠使用前要

19、首先要進行處理。 1）估計用量 選擇好凝膠的類型后，首先要根據(jù)選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無水的干膠，所以要計算干膠用量： 干膠用量(g)柱床體積(ml)/凝膠的床體積(ml/g) 由于凝膠處理過程以及實驗過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計算的基礎(chǔ)上再增加1020(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。,不同類型的凝膠所需的膨化時間不同。一般吸水率較小的凝膠(即型號較小、排阻極限較小的凝膠)膨化時間較短，在20條件下需34 h；但吸水率較大的凝膠(即型號較大、排阻極限較大的凝膠)膨化時間則較長。如果加熱煮沸，則膨化時間會大大縮短，一般在15 h即可完成，而且煮沸也可以去除

20、凝膠顆粒中的氣泡。但應(yīng)注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。 瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理。另外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。,3)、水中膨化,膨化處理后，要對凝膠進行純化和排除氣泡。純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會影響分離效果，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。,4)、排除凝膠中氣泡,4）凝膠的保存 凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦┩ǔ＜尤?.02(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的疊氮化鈉，4下保存。如果要較長時間的保存，則要將凝膠

21、洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過濾抽干后浸泡在50(體積分?jǐn)?shù))的乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復(fù)浸泡脫水，至95(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水后將凝膠抽干。置于60烘箱中烘干，即可裝瓶保存。注意膨化的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。,5) 凝膠層析的基本操作,（1）層析柱的選擇 層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100 cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長度比一般在1：25

22、1：100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。,（2）裝柱（凝膠層析柱）,a.除去氣泡的溶脹凝膠應(yīng)與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度也要恒定。 b.應(yīng)調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當(dāng)稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除。 c.將柱子固定在穩(wěn)定的支架上，并保證其垂直。 d.先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要捧除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15。,5) 凝膠層析的基本操作,e.柱頊接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注人柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)生氣泡。 f.柱裝好后，停10min，然后打開出液口，排出過量洗

23、脫劑。,5) 凝膠層析的基本操作,g.柱內(nèi)膠面上部保留23cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來。 h.調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速。檢查流體靜力壓，不要超過規(guī)數(shù)值。如果使用蠕動泵，注意使流速不超過穩(wěn)定后利用重力調(diào)節(jié)所達到的流速，一般要低于后者10。,5) 凝膠層析的基本操作,i. 檢查柱裝得是否均勻和V0的測定：用一個為該凝膠完全排阻的有色大分子物質(zhì)作樣品進行層析，則既檢查了裝柱質(zhì)量也測定了V0。層析時，若有色區(qū)帶移動不整齊，說明柱裝得不好。此大分子的洗脫體積(Ve)就是該凝膠柱的空體積(V0)。藍色葡聚糖2000是平均分子質(zhì)量

24、為2106Da并與藍色染料偶聯(lián)的一種葡聚糖，通常用它來測 V0，對于葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和6 以上的瓊脂糖凝膠均可用0.2 濃度的藍色葡聚糖2000，它在265nm及630nm處都有吸收峰。,5) 凝膠層析的基本操作,6)洗脫液的選擇 由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不像其他層析分離方式主要依賴于溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴于流動相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其他層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴(yán)格。,由于凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩(wěn)定工作的pH值

25、范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽.,7)加樣量 要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結(jié)果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據(jù)具體的實驗要求而定：分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%(一般約0.5-2ml)，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30%。 分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。,如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分

26、析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當(dāng)增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的黏度不能過大，否則會影響分離效果。,8)洗脫速度 洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。 一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，而且

27、實驗時間會大大延長；所以實驗中應(yīng)根據(jù)實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預(yù)備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是210 mlh，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。,總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據(jù)具體的實驗要求來選擇。,16.3.8親和層析 (Affinity Chromatography),許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性。例如：酶與輔酶或酶與底物，抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖（或糖蛋白、細胞表面受體），核酸與互補鏈（或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）以及細胞與細胞表面特異蛋白（或凝集素）等。,16.3.8.1親和層析的原理,親和層析法就是