1、RhD(-)血型的研究進(jìn)展,合肥市紅十字會(huì)中心血站 呂蓉 2008-5,RH血型的研究歷史,19世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)了人類紅細(xì)胞RH血型 19世紀(jì)60年代,發(fā)現(xiàn)了RH血型不合的有效治療方法 19世紀(jì)80年代,成功分離了RH蛋白 19世紀(jì)90年代,認(rèn)識(shí)了RH基因結(jié)構(gòu) 20世紀(jì)90年代,清楚了RHD和RHCE的氨基酸序列,RH血型系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),1940年,發(fā)現(xiàn)多數(shù)人紅細(xì)胞上有一種血型抗原物質(zhì),與恒河猴（Rhesus monkey)紅細(xì)胞的抗原物質(zhì)是相同的. 1940年還發(fā)現(xiàn),三例ABO血型相同，同種輸血后卻發(fā)生了嚴(yán)重的輸血反應(yīng). 同一年，一名O型孕婦產(chǎn)后大出血，輸入O型丈夫的血液后發(fā)生了溶血性輸血反應(yīng)，

2、這是人類由于妊娠產(chǎn)生的同種免疫作用的第一例報(bào)告 這就表明除ABO血型系統(tǒng)外,還存在另外的血型系統(tǒng).,RH血型系統(tǒng)的命名,“Rh”是根據(jù)恒河猴英語單詞的前兩位字母而由來 我們現(xiàn)在通常把紅細(xì)胞上含有D抗原的稱為RH陽性，而不含有D抗原的稱為RH陰性 RH系統(tǒng)還有C、c 、E 、e 四種抗原，也有用1、2、3、4、5來表示，D+紅細(xì)胞有用RH1表示，而D-細(xì)胞用RH-1來表示，相應(yīng)的等位基因用R1和R-1來表示,RH血型的意義,臨床意義很大! RH陰性的個(gè)體在亞洲漢族人當(dāng)中很稀有,比率為0.3%左右,在歐美等白種人中,比例較高為15%左右. RH血型不合的輸血,有可能產(chǎn)生危及生命的溶血性輸血反應(yīng),母

3、子RH血型不合的妊娠有可能發(fā)生新生兒溶血病,嚴(yán)重者可導(dǎo)致新生兒死亡,或是使胎兒死于子宮內(nèi). RH血型的檢查和ABO血型同等重要,已被列為血型的常規(guī)檢查之一.,RH血型是如何遺傳的?,RH(-)基因是隱性基因. 當(dāng)RH陽性的父母都帶有RH陰性基因,且同時(shí)遺傳給后代時(shí),其后代即表現(xiàn)為RH陰性. 當(dāng)雙親中有一人是RH(-)時(shí),其子女為RH(-)的機(jī)會(huì)增大.,RHD(-)有何意義?,正常RH陰性者，血漿中不含抗-D抗體，所以當(dāng)RH陰性的人第一次輸入RHD陽性血液時(shí)，不會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng)，但此時(shí)RH陰性者卻會(huì)由于各種免疫而產(chǎn)生抗D抗體，當(dāng)再次輸入RHD陽性的血液時(shí)，就發(fā)生嚴(yán)重的輸血反應(yīng)甚至造成死亡. RH陰

4、性的婦女懷有RH陽性的胎兒,胎兒的紅細(xì)胞就會(huì)刺激母體產(chǎn)生抗-D抗體,當(dāng)再次懷有RHD陽性的胎兒時(shí),就會(huì)導(dǎo)致新生兒溶血性貧血而死亡.,RHD(-)者如何自我保護(hù)?,RH陰性者在任何情況下都不能輸入RH陽性的血液，必須輸注相同的RH陰性血，以免由于RH不合而發(fā)生輸血反應(yīng)。80%的RH陰性病人在輸入200MLD陽性紅細(xì)胞后,在2-5個(gè)月后,血漿中可檢測到抗體. RH陰性的婦女應(yīng)注意婚后避免流產(chǎn)，保證第一胎正常分娩，以防發(fā)生RH新生兒溶血病。有資料統(tǒng)計(jì)14.3%的多次妊娠的D陰性孕婦產(chǎn)生抗-D抗體，導(dǎo)致新生兒溶血病。,血站為RHD(-)者做哪些工作?,常年在數(shù)以萬計(jì)的供血人群中篩選RHD(-)的供者

5、對(duì)有流產(chǎn)史的RH陰性的婦女，在妊娠初期做一些關(guān)于RH血型系統(tǒng)的產(chǎn)前免疫檢查。 一旦發(fā)生RH新生兒溶血病，在新生兒剛生下來就要立即用RH陰性的同型血液進(jìn)行換血治療，挽救新生兒的生命。,表型與D抗原,Rh陽性和Rh陰性 弱D和部分D（弱D表現(xiàn)型） D放散型（Del、DEL）,弱D型(Weak D),血清學(xué)表現(xiàn)為鹽水介質(zhì)陰性,IAT檢測為陽性. D抗原數(shù)量的減少,但抗原表位數(shù)目基本不變.抗原的質(zhì)量不變 堿基突變形成，改變的氨基酸位于細(xì)胞膜層的中間或細(xì)胞膜層內(nèi),部分D(Partial D),紅細(xì)胞缺少某些（部份）的抗原表位 與正?？乖啾龋乖馁|(zhì)量發(fā)生了變化.(正常紅細(xì)胞上抗原包含個(gè)表位） 形成原因

6、：基因單或多核苷酸堿基取代、雜交基因。 所改變的氨基酸位于抗原分子的細(xì)胞膜外部分.,部分的危險(xiǎn)在哪？,許多部分的紅細(xì)胞與抗直接反應(yīng)，但有些需要用才能鑒定，細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度不一樣，取決于試劑的制造商 部分的個(gè)體是可以產(chǎn)生抗，因此必須接收的血液，在日常工作中許多部分都被定為，往往在產(chǎn)生抗體以后才被發(fā)現(xiàn),DEL型(D 放散型),鹽水介質(zhì)陰性,IAT檢測陰性,但吸收放散試驗(yàn)陽性. 紅細(xì)胞上D抗原數(shù)目比弱還要少,紅細(xì)胞上D抗原的質(zhì)量也有變化的 某些型紅細(xì)胞抗原缺失某些表位，可以產(chǎn)生抗抗體. 第九外顯子堿基突變形成.,典型的抗原密度比較,RHD基因進(jìn)化,RHAG RHce RHce和RHce復(fù)制體 RHCE

7、基因和RHD基因,RHD基因的進(jìn)化,RHD基因的祖先基因是Rh 相關(guān)糖蛋白基因(RHAG 基因),該蛋白有一條N多糖鏈.RHAG和RHD、RHCE有38%的同源性，在紅細(xì)胞上具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，由位于6號(hào)染色體上的單個(gè)基因編碼。RHAG不具有多態(tài)性，所以它不攜帶血型抗原，但是它對(duì)RHD和RHCE定向到膜上有重要作用。沒有RHAG，RHCE和RHD都不能表達(dá)到紅細(xì)胞膜上.在紅系的分化中先表達(dá)RHAG,然后表達(dá)RHCE,再表達(dá)RHD. RHAG基因首先復(fù)制形成Rhce基因, 第二次復(fù)制發(fā)生在同一染色體短臂,形成“Rhce 復(fù)制體”,隨后Rhce基因 和其復(fù)制體沿不同的途徑進(jìn)化,最終形成現(xiàn)今人類的R

8、HD基因,而RHce 基因經(jīng)過突變或與RHD基因發(fā)生交換形成常見的Rhce RHcE RHCe RHCE基因.,RhD基因結(jié)構(gòu),RH基因結(jié)構(gòu)目前已確定:位于染色體1p34.3-36.1,主要由RHD和RHCE兩個(gè)基因組成.這兩個(gè)基因的 3, 端相對(duì),相隔約有 3萬bp.在它們之間為小膜蛋白1基因(SMP1),即SMP1基因. 在RHD基因兩側(cè)各有一段約9000bp 的側(cè)翼序列片段,稱為RH盒子(Rhesus box )序列,5端為上游R盒子(Upstream),長9142bp ,3端為下游R盒子(Downstream Rhesus box),長為9145bp ,上下游盒子方向相同,與RHD基因

9、一致. RHD和RHCE基因各由10個(gè)外顯子組成,二者有43個(gè)堿基有差異,其中第1、2 、8外顯子序列基本一致，所以絕大多數(shù)RHD基因測定中，引物選擇擴(kuò)增RHD基因的3-7以及9-10外顯子。 通常只有D抗原陽性個(gè)體擁有一或二條RHD基因，而D陰性個(gè)體則缺失RHD基因，RHD陰性個(gè)體的RHD基因缺失發(fā)生在上下游盒子之間，并形式一個(gè)融合（Hybrid Rhesus box)。,RHD基因locus,RH 和基因結(jié)構(gòu)圖,1p36.11,RHD等位基因的形成,基因缺失：RHD基因完全缺失形成RHD(-)單倍體； 基因交換：由于RHD基因和RHCE基因在RH座位上方向相反，二個(gè)同源基因之間發(fā)生交換的機(jī)

10、率增大，通常RHCE基因?yàn)楣┱呋?，RHD為受者基因； 堿基變異：包括突變、缺失、mRNA拼接位點(diǎn)變異等。,近幾年的研究發(fā)現(xiàn),D基因結(jié)構(gòu)存在種族差異,RhD(-)白種人中,D基因是完全缺失的. 在黑人中,RHD（-）個(gè)體，D基因卻完整存在，66%的D基因在第3內(nèi)含子和第4外顯子之間有37bp的插入片斷，導(dǎo)致了抗原的不表達(dá)。 黃種人中RhD(-)個(gè)體表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性.,黃種人D基因的多態(tài)性,D基因完全缺失(10個(gè)外顯子全部缺失)導(dǎo)致了D抗原的不表達(dá). D基因的部分缺失,(有兩邊缺失和中間缺失)導(dǎo)致D抗原的不表達(dá). D基因完整存在,(堿基突變),導(dǎo)致D抗原不表達(dá).,RHD基因陽性、D抗原陰性等位

11、基因 基因交換形成的融合等位基因,RHD基因陽性、D抗原陰性等位基因 堿基變異形成的等位基因,Del等位基因,all DEL alleles are associated with Ce,K409K又叫1227A,指第九外顯子最后一個(gè)基因GA突變，也是第九外顯子與第九內(nèi)含子拼接位點(diǎn)的堿基突變，雖然位置氨基酸末改變，但是剪接點(diǎn)突變導(dǎo)致產(chǎn)生了不正常的抗原,弱D等位基因（種）,部分D等位基因,中國人RhD分子背景,中國人RhD分子背景,D陽性個(gè)體的RHD基因與在其它民族中報(bào)道的正常RHD基因序列相同； 真實(shí)D陰性中國人中以RHD-CE(2-9)-D2等位基因?yàn)橹?，比率?0.5%； 同時(shí)還存在比率不

12、低的個(gè)體因堿基變異導(dǎo)致RHD基因ORF錯(cuò)位，導(dǎo)致正常D抗原不能表達(dá)。 在真實(shí)D陰性中國人中RHD基因總陽性率為15.8%,中國人RhD分子背景,中國人Del個(gè)體主要攜帶RHD 1227A等位基因(K409K)。該等位基因是Genbank收錄的第一個(gè)Del等位基因 (GenBank記錄AF390110)，但也是中國人中唯一發(fā)現(xiàn)的Del等位基因，而在歐洲人中除RHD1227A等位基因外，還觀察到另外幾種Del等位基因 弱D表型個(gè)體目前發(fā)現(xiàn)主要是弱D15型、還發(fā)現(xiàn)了2例RHD 1227A等位基因攜帶者； 部分D表型觀察到DVa(Hus)和DVI III型。,中國人RHD等位基因,RHD基因分型技術(shù)的應(yīng)用,血清學(xué)定型結(jié)果難以判定,為了防止某些弱D被誤定為RH-,用分子生物學(xué)檢測作為輔助手段； D抗原弱陽性個(gè)體的弱D型或部分D型別的鑒定； 通過羊水預(yù)測胎兒的D表型； 慢性多次輸血患者、大量輸血患者、同種免疫或自身免疫溶血性貧血患者、以及紅細(xì)胞直接抗球蛋白實(shí)驗(yàn)陽性患者的D抗原表型的檢測和糾正； 對(duì)于中國人，鑒定Del表型,中國人RHD的未來研究方向,真實(shí)D陰性個(gè)體RHD基因序列研究，進(jìn)一步了解產(chǎn)生中國人D抗原陰性的特性分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多的RHD等位基因 ： D抗原弱表現(xiàn)型個(gè)體的分子背景研究，用以了解中國人弱D和部分D表型的常見型及頻率。目前在中國人