1、生化反應(yīng)曲線,生化分析基本原理,生化反應(yīng)曲線,內(nèi)容概況,羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線,Cobas 6000 (c501) 600T/H,Modular D 2400T/H,Modular P 800T/H,Cobas c311 300T/H,Cobas c111 180T/H,Cobas 8000 2000T/H,cobas 8000 模塊化組合分析系統(tǒng) 智能、高效、強勁,物質(zhì)對光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律,LambertBeer定律表達為: 當(dāng)一束平行的單色光通過含有均勻吸光物質(zhì)的溶液時,溶液的吸光度(A)與溶液的濃度(C)和光透過液層厚度(L)的乘積成正比。物質(zhì)對光吸收的吸光

2、系數(shù)（e）為常數(shù)。 其數(shù)學(xué)表達式：A = e*C*L,I,入射光,透射光,I0,=,=,-光吸收的基本定律,=,light detector,根據(jù)Lambert- Beer定律來計算待測物濃度 如若吸光系數(shù) ( )未知，我們就需要采用定標(biāo)曲線 來計算待測物的濃度。,Concx = Absx x Concs Abss Concx = 待測樣本濃度 Concs = 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 Absx = 樣本吸光度 Abss = 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度,此值為定值,Lambert-Beer 定律 適合于任何均勻非散射的介質(zhì),生化比色分析,特定蛋白透射比濁分析,Lambert-Beer 定律,分光光度法定量分析的依據(jù),Ro

3、che Hitachi Photometer,當(dāng)相應(yīng)的比色杯每一次通過光路系統(tǒng)時，光路系統(tǒng)會測量并記錄下相應(yīng)的吸光度 光路系統(tǒng)可以測量后分光后12個波長的相應(yīng)吸光度。 12 有效波長: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多數(shù)檢測項目都使用雙波長檢測方法。（可去除干擾物對檢測結(jié)果的影響）,Reaction sequence,儀器讀數(shù)的原理,不同儀器每個循環(huán)周期的時間間隔 Modular P 18秒 Cobas c702 16秒 Cobas C501 8秒 Modular D 12秒 C311 12秒,反應(yīng)轉(zhuǎn)盤

4、不停的周期旋轉(zhuǎn),當(dāng)相應(yīng)的比色杯通過光路系統(tǒng)時，光路系統(tǒng)會測量并記錄下相應(yīng)的吸光度,在不同的時間點加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑,Reaction sequence,Instrument cycle,Endpoint and rate (kinetic) assays,自動生化分析常用的方法有:,終點法（End Point Assays）：一般在整個反應(yīng)完成后再來檢測吸光度 速率法（Rate assays） ：一般在反應(yīng)的過程中監(jiān)測吸光度的變化情況,終點分析法,時間,吸光度,A 1,t,S+R1,基于 被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中到達反應(yīng)終點或平衡點，根據(jù)該點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法。,終點法的計算：

5、 從時間-吸光度曲線來看，到達反應(yīng)終點時，吸光度將不再變化。在達到終點時任取一點進行測定，此時底物和產(chǎn)物的量都不再變化。,吸光度,A 1,S+R1,吸光度,兩點終點法（2-point end） 一點終點法 （1-point end） 一點終點單試劑（1-point endpoint assay one reagent） 一點終點雙試劑（1-point endpoint assay two reagents） 三點終點法（3-point end）,終點分析法（Endpoint assays）,兩點終點法,在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時，選擇第一個吸光度，在反應(yīng)到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，

6、此兩點吸光度之差用于計算結(jié)果。,去除了樣本的本底 采用兩個測量點 針對兩個或多個試劑的項目 第一個讀數(shù)點一般選在添加最后一個試劑之前 第二個讀數(shù)點一般選在加入最后一個試劑之后且已經(jīng)達到了反應(yīng)終點,兩點終點法的特點,Endpoint assays,兩點終點法的反應(yīng)曲線Cobas c702,Endpoint assays,Sample+R1,Mp1 abs before addition of R3,Mp2 abs at reaction end,兩點讀數(shù)的時間點: 第19點測量包含了樣本和試劑1的本底 sample + reagent 1 第 38點在加入所有試劑后，反應(yīng)達到終點 sample

7、+ reagent 1+ reagent 2,兩點終點法的應(yīng)用參數(shù) Cobas c702,2Point Endpoint assay application settings,RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM,兩點終點法分析項目舉例,Endpoint assays,一點終點法,A單試劑一點終點法 例如:CHOL/TG.,在反應(yīng)到達終點，即在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，用于計算結(jié)果。,B雙試劑一點終點法 Mg(雙試劑),單試劑一點終點法的特點（1-point endpoint assay one reagent） 不包含樣本的本底 僅進

8、行一個點的測量 檢測項目舉例：甘油三酯（TG）,Endpoint assays,單試劑一點終點法的反應(yīng)曲線1-point endpoint assay one reagents,Endpoint assays,不包含樣本的本底 僅進行一點測量 應(yīng)用項目舉例： Magnesium 不采用兩點終點法主要是樣本和R1體積相加仍180uL(最小反應(yīng)體積，無法測量）,雙試劑一點終點法的特點（1-point endpoint assay two reagents）,1st entry: 方法類型 2nd entry:總分析時間 3rd - 6th entry:測量點,一點終點法應(yīng)用參數(shù)（1 Point E

9、ndpoint assay）,Utility - Application - Analyze,TRIGL CHO,一點終點法分析項目舉例,Endpoint assays,例如,多項同測組合試劑盒,CHO與TG同一測定,即雙終點法,在一個通道內(nèi)一次進行兩項反應(yīng)相關(guān)的終點法測定.,三點終點法,上升 increasing 或 下降decreasing,終點法反應(yīng)的方向（Reaction Direction）,速率法,吸光度,t,t2,t1,t3,t4,A1,A2,A3,S+R,時間,A 1,利用線性反應(yīng)期，計算出單位時間的吸光度變化A/min，來計算酶的活性。,單位時間的吸光度變化量是一致的,在酶促

10、反應(yīng)過程中,在反應(yīng)速度恒定期(線性反應(yīng)期)來連續(xù)觀察和記錄一定 反應(yīng)時間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法.,速率A法 （Rate A） 兩點速率法（2-point Rate）,速率法（Endpoint assays）,速率A法,A 單試劑速率法 例如:ACPAFU,B 雙試劑速率法 例如:ALTASTCK,在較長的反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi),每隔一定時間讀取一次吸光度值,至少讀取4點,得到3個A,求出單位時間的反應(yīng)速率 A/min . 通過最小二乘法（least squares method）,Rate A assay Modular P,Reag. at R3 timing,Rate assays,G

11、OT/ASTGGT GPT/ ALT Lipase ALPGLDH AmylaseLDH CHE CKMB,速率A 法-分析項目舉例,Rate assays,2點速率法,2點速率法,尿素氮,指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦 非終點吸光度，這兩點的單位時間吸光度差值用于結(jié)果計算。,2-point Rate assay,Rate assays,Enzyme,采用一種或多種試劑 檢測兩個測量點檢測固定的間隔時間內(nèi)兩點的吸光度變化。 換算成 Abs/min參與計算 在加入最后最后一個試劑之后進行吸光度檢測。,兩點速率法的特點2-point Rate assay,Rate

12、 assays,2-point Rate assay Modular P,Rate assays,Ammonia Acid phosphataseNon-prostatic phosphatase Urinary/CSF protein Bicarbonate Urea,Rate assays,2點速率 法-分析項目舉例,Reaction Direction,上升decreasing 或 下降increasing,生化反應(yīng)曲線,Thank you for your attention,Roche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031 China,This presentation is our intellectual proper