1、多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷,一、基礎(chǔ)知識,（一）DNA分子的結(jié)構(gòu),C、H、O、N、P,1、組成元素,脫氧核苷酸,2、基本單位,3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu),一個核苷酸上的磷酸基團上的“OH”和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3、5、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端,4、多脫氧核苷酸鏈得形成,脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式,多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖,5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu), DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為35，

2、另一條鏈為5 3 ）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu),脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè),兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對,6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算,規(guī)律一：DNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等，任意兩個互補的堿基之和相等即A=T，G=C。任意兩個不互補的堿基之和恒等，占堿基總數(shù)的50%。即：A+GT+CA+CT+G50%，（A+G）/(T+C)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)1,規(guī)律二：在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補鏈

3、的 (A+G) /(T+C)的值互為倒數(shù)關(guān)系,規(guī)律三：DNA雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與整個DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等,（二）DNA分子的特性,1、穩(wěn)定性,在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，通過氫鍵形成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來,例題：甲DNA分子中，A和T占25，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25， A和T 占75%，哪一個穩(wěn)定？,答：甲DNA分子比乙DNA分子穩(wěn)定。因為A與T之間形成兩個氫鍵，在G和C之間形成三個氫鍵，三個氫鍵比兩個氫鍵穩(wěn)定，所以在DNA分子中含有較多的GC堿基

4、對比含有較多的AT堿基穩(wěn)定,2、多樣性,構(gòu)成DNA分子的堿基對的數(shù)量不同，堿基對的排列順序千變?nèi)f化,例題：如果有4000個堿基對，堿基對有多少種排列方式？,答：堿基對排列方式有44000種,3、特異性,不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在差異，因此每一個DNA分子的堿基對都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的,（三）DNA的復制,2、時期,有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期,3、場所,細胞核（主）、線粒體、葉綠體,4、模板,DNA母鏈,1、概念,由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程,5、原材料,脫氧核苷酸,6、基本

5、條件,酶、ATP、原料、模板,7、復制過程, DNA的解旋,親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈, RNA引物的合成,以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物, DNA的生成,以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。,切掉引物生成岡崎片斷,在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷, DNA片斷的連接,在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA,邊解旋邊復制(過程）,8、復

6、制特點,半保留復制（結(jié)果）,9、遵循原則,堿基互補配對原則,10、精確復制的原因,11、復制的意義,DNA分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性,規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復制提供了精確的模板,堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行,一條雙鏈DNA分子，復制N次，形成的子代DNA分子中，含親代DNA母鏈的有兩個DNA分子，占子代DNA總數(shù)的2/2N；親代DNA分子母鏈兩條，占子代DNA中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的2/2 N+1= 1/2N,設(shè)一條DNA分子中有胸腺嘧啶為m個，則該DNA復制n次后，形成子代DNA分子需游離的胸腺嘧啶為T=(2N-1)m,12、DNA復制過程中的等量

7、關(guān)系,（四） PCR(多聚酶鏈式反應(yīng)）,1、 DNA聚合酶特性,不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此， DNA復制需要引物,2、 DNA聚合酶作用過程,當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后， DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈， DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸,3、 PCR原理,在80100C的溫度范圍內(nèi)， DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性,當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈, PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器,

8、高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化,4、 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用,5、 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì),DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行,PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出,6、 PCR技術(shù)的特點,7、細胞內(nèi)和細胞外DNA復制環(huán)境的區(qū)別, PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，

9、其長度通常為2030個脫氧核苷酸,8、細胞內(nèi)復制和PCR不同點, PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的,（五） PCR的反應(yīng)過程,1、PCR的反應(yīng)步驟,PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復性和延伸,變性（模板DNA解旋）,模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備,2、循環(huán)過程,復性（退火）,模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,延伸,DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作

10、用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈,3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量,4、PCR 循環(huán)的結(jié)果, DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增,從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進行DNA的延伸,二、 PCR 的實驗操作,1、PCR儀,（一）設(shè)備及用具,實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器,2、微量離心管,一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml,3、微量移液器,用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次,PCR

11、儀,1、準備,2、移液,（二）實驗操作步驟,按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上,用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑,過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁,注意：,3、混合,B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻,A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢,將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序,過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s,4、離心,5、反應(yīng),離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果,PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：

12、,6、注意事項,隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；,分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭,（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算,三、課題成果評價,1 、一條DNA，復制n次， DNA為2 n,2 、 a條DNA，復制n次， DNA為a x2 n,（二）實驗中DNA含量的測定,1 、原理,可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān),2 、過程,稀釋,2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋,對照調(diào)零,以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零,取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值,計算,計算,DNA含量（ g ）50 x (260nm的讀數(shù)） x 稀釋倍數(shù),50：1 g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02,比色杯,四、 課題延伸,例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）,PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出特點,五、實驗小結(jié),PCR儀加熱使（ ）變性, 復性使引物與模板DNA（ ）,