1、第十六章 RNA的生物合成 （轉(zhuǎn)錄）,RNA Biosynthesis, Transcription,以一段DNA鏈為模板合成RNA的過程,轉(zhuǎn)錄（transcription）,轉(zhuǎn)錄過程動畫,轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的相同點(diǎn)： 1. 模板均為DNA 2. 本質(zhì)都是形成磷酸二酯鍵 3. 方向均為53,轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的區(qū)別,意義 遺傳信息傳遞 遺傳信息表達(dá),第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的模板和酶 Templates of Transcription and Enzymes,一、轉(zhuǎn)錄模板,能轉(zhuǎn)錄出RNA的DNA區(qū)段,模板鏈 (template strand),編碼鏈 (coding strand),編碼鏈,模板鏈,模板鏈、編碼鏈與轉(zhuǎn)錄

2、及翻譯的關(guān)系,不對稱轉(zhuǎn)錄 (asymmetric transcription) 對某一基因，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄； 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。,結(jié)構(gòu)基因、不對稱轉(zhuǎn)錄,依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP） 不需要引物 無校讀功能,二、RNA聚合酶（RNA-pol）,核心酶 (2),全酶 (2),（一）原核生物的RNA聚合酶,原核生物RNA聚合酶亞基的功能,利福平與亞基相結(jié)合，從而抑制酶的活性,（解鏈）,催 化,辨認(rèn)起始點(diǎn),RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合,操縱子：轉(zhuǎn)錄單位或轉(zhuǎn)錄區(qū)段,啟動子,RNA-Pol,原核生物一個轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個

3、結(jié)構(gòu)基因及其上游調(diào)控序列。 模板DNA上被RNA聚合酶識別并結(jié)合的部位稱為啟動子(promoter)。是調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位,三、 模板與酶的辨認(rèn)識別：,RNA聚合酶保護(hù)法,3、核酸酶消化 水解未保護(hù)DNA,4、蛋白酶消化RNA-Pol 釋放被保護(hù)的DNA,DNA分子,1、分離一段基因片段,2、加入純化RNA-Pol,原核生物轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的一致性序列,原核生物啟動子的保守序列,DDRP的移動,-40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 +5 +10 +15 +20 +25,啟動子保守序列,開始轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),1,第二節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄合成的過程,The Process of R

4、NA Biosynthesis,（一）原核轉(zhuǎn)錄起始,一、原核生物的轉(zhuǎn)錄過程,轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個問題： RNA-pol必須識別并結(jié)合地結(jié)合起始區(qū)域 DNA雙鏈解開,原核生物的轉(zhuǎn)錄起始,亞基辨認(rèn)-35區(qū),RNA pol 全酶移向-10區(qū)， 打開雙鏈,合成第一個磷酸二酯鍵,5-pppGpN-OH-3,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,亞基脫落,（結(jié)合松弛）,（結(jié)合緊密）,轉(zhuǎn)錄起始不需引物！,RNA-pol (2) DNA pppGpN- OH 3,原核轉(zhuǎn)錄起始,RNA-pol (2) DNA pppGpN- OH 3,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,1. 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

5、2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。,（二）原核轉(zhuǎn)錄延長,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,轉(zhuǎn)錄空泡(轉(zhuǎn)錄復(fù)合物)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,目 錄,轉(zhuǎn)錄也需拓?fù)洚悩?gòu)酶的參與,RNA聚合酶,核糖體,RNA,原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象,轉(zhuǎn)錄延長動畫,原核RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機(jī)制有兩種： 1依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止 2非依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止：,（三）原核轉(zhuǎn)錄終止, 因子是個同六聚體； 因子能結(jié)合RNA，與poly C的結(jié)合力最強(qiáng)； 因子有ATP酶和解螺旋酶的活性。,富含C,RNA,+ATP,DNA,依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止,RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成

6、寡聚U及發(fā)夾形的二級結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動停止，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。,2非依賴Rho的轉(zhuǎn)錄終止：,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUU

7、UUU. 3,莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu),莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理,發(fā)夾使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； A-U配對最不穩(wěn)定，使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。,非依賴的轉(zhuǎn)錄終止,第三節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄過程,The Process of Transcription in Eukaryote,生化教研室 雷 康 福 610939 ,（mRNA前體）,一、真核生物的RNA聚合酶,羧基末端結(jié)構(gòu)域 (carboxyl-terminal domain, CTD),RNA聚合酶最大亞基的羧基末端有一段共有序列為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-

8、Pro-Ser重復(fù)序列片段,這一序列在RNA 聚合酶中是獨(dú)一無二的。 所有真核生物的RNA聚合酶都具有CTD，只是共有序列的重復(fù)程度不同。 磷酸化的CTD在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮作用。,二、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程,（一）真核轉(zhuǎn)錄起始,真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時，真核RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。,可影響自身基因表達(dá)的DNA序列統(tǒng)稱為順式作用元件,1. 真核轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段,（Hogness盒）,2. 轉(zhuǎn)錄因子,能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合另一基因的DNA序列，影響其表達(dá)的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因

9、子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(trans-criptional factors, TF)。,參與RNA-pol 轉(zhuǎn)錄的TF,3. 轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物 (pre-initiation complex, PIC),真核生物RNA-pol不能直接與DNA分子結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。,A,B,由RNA-Pol 催化轉(zhuǎn)錄的PIC,H,E,首先，TFD的TBP亞基在另一亞基TAF輔助下， 由TFA和B促進(jìn)及配合，結(jié)合在DNA分子的TATA上， 形成TFD-A-B-DNA復(fù)合物,最后TFH進(jìn)入，PIC組裝完成，TFH使CTD磷酸化。,TFB作為橋梁并提供表面，促進(jìn)已與TFF結(jié)合的R

10、NApol進(jìn)入啟動子的核心區(qū)TATA。 接著TFE進(jìn)入，靠ATPase活性協(xié)同RNApol解開DNA雙鏈局部。,真核轉(zhuǎn)錄起始,與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步。,轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體解聚和移位現(xiàn)象。,（二）真核轉(zhuǎn)錄延長,轉(zhuǎn)錄延長中的核小體移位,RNApol前移將遇到核小體,原來繞在組蛋白上的DNA解聚及彎曲,一個區(qū)段轉(zhuǎn)錄畢，核小體移了位,（三）真核轉(zhuǎn)錄終止,真核生物轉(zhuǎn)錄終止與轉(zhuǎn)錄后修飾，即poly A尾巴結(jié)構(gòu)的添加密切相關(guān)。 在poly A修飾位點(diǎn)的下游存在一組共同序列AATAAA和GTGTGT，為轉(zhuǎn)錄終止的識別修飾位點(diǎn)。,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾,3proc

11、essing,5mGpppGAAUAAAPoly（A）,AATAAAGTGTGTG,5,PAUSE,3,5,Release,5AAUAAA,GUGUGUG,轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn),3,第四節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾,Section Post-transcriptional Modification in Eukaryote,幾種主要的加工方式,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修飾(modification),4. 添加(addition),一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 (一)首尾的加工 1. 5-端加帽：m7GpppG 2. 3-端加尾：多聚腺苷酸 (poly A),帽

12、子結(jié)構(gòu),帽子結(jié)構(gòu)的生成,帽子結(jié)構(gòu)的修飾,Poly（A）尾作用：穩(wěn)定mRNA；提高mRNA翻譯效率；mRNA轉(zhuǎn)運(yùn) .,2加尾（adding tail）：,（二）mRNA的剪接,雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖,mRNA,DNA,1. mRNA來自hnRNA,核酸序列分析證明： mRNA是去掉大部分中間片段的hnRNA。 核酸雜交實(shí)驗(yàn)證明： hnRNA與DNA模板鏈可以完全配對； 而mRNA與DNA模板鏈雜交則出現(xiàn)部分配對的局部雙鏈區(qū)域和中間相當(dāng)多的套索狀的單鏈區(qū)段。 因此提出真核生物斷裂基因的概念。,真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼序列和非編碼序列互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再

13、連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。,斷裂基因(splite gene),非編碼區(qū) AG,編碼區(qū)17,2. 外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron),外顯子在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列（初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上有，成熟轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上也有的序列） 內(nèi)含子隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列（初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上有，成熟轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上沒有的序列）,外顯子,內(nèi)含子,DNA,mRNA,轉(zhuǎn)錄,形成套索RNA，外顯子靠近,并接體,去除套索RNA，連接外顯子,成熟mRNA,3. mRNA的剪接,snRNP與hnRNA結(jié)合成為剪接體（剪接場所）,目 錄,套索剪切模式,內(nèi)含子剪接接口： 5 GUAG-OH- 3,snRNA與核內(nèi)蛋白質(zhì)組裝形成小核蛋白體（snRNP）,剪接過程的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng), RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differential RNA proces