1、卵黃抗體生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)進展,李建濤 2003年6月,內(nèi)容,一、生產(chǎn)技術(shù) 二、應(yīng)用技術(shù) 三、問題及展望,一、 生產(chǎn)技術(shù),(一) IgY產(chǎn)生過程 (二) IgY轉(zhuǎn)移時間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因素 (三）IgY結(jié)構(gòu)特點 (四) IgY相對與IgG的優(yōu)勢 (五) IgY純化、活性測定及保存,(一) IgY產(chǎn)生過程,1.腔上囊是禽類特有的控制體液免疫的淋巴器官； 2.腔上囊中B細胞受到抗原刺激后分化成漿細胞，后者 分泌抗體進入血液； 3.通過血液循環(huán)和輸卵管上皮層分泌濾泡，產(chǎn)蛋雞將母 源抗體選擇性分泌到卵黃內(nèi)； 4.卵黃中Ig主要是IgG，叫IgY（IgM和IgA轉(zhuǎn)移到蛋清中）； 5.小雞通過IgY實現(xiàn)獲得

2、性被動免疫(豬、牛、馬屬通過初乳；兔通過胎盤)； 6.卵黃中含有多種不同抗體（約200種，滴度取決于暴露程度；M.Coleman,2000)； 7.用某種病原菌免疫母雞，可產(chǎn)生特異性IgY， Sugita等（1996）用26種甲醛滅活病原菌免疫產(chǎn)蛋雞，IgY 可預(yù)防多種疾病。,(二) IgY轉(zhuǎn)移時間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因 素,1.用HI、ELISA、ID檢查卵黃中IgY，抗體應(yīng)答形成時間 晚于血清12周（Theresa H P,1985；鴨腺病毒），以后與血清測得的HI滴度一致，也有報道卵黃卵黃抗體具有累積作用； 2.經(jīng)加強免疫，卵黃中特異性IgY效價能維持數(shù)月奶至1年； 3.一個卵黃約含100

3、400 mgIgY，一只產(chǎn)蛋雞每年可獲 得4050gIgY（D .Carlander,2002），相當(dāng)與30只家兔同期內(nèi)血清IgG 產(chǎn)量； 4.卵黃中抗原特異性抗體數(shù)量占IgY平均10%，范圍是5%（抗胰島素抗體）28%（抗鼠IgG抗體），取決于免疫個體、免疫程序及抗原的免疫原性；,續(xù)（2）,5.影響IgY產(chǎn)量的因素包括： （1）抗原的質(zhì)與量（顆粒/可溶性抗原、類毒素/菌體抗原、活菌/死菌，免疫麻痹；高免疫原性和安全） （2）機體方面，A包括產(chǎn)蛋雞品種（來航雞、洛島紅雞及其雜交后代的特異性IgY最高平均濃度有顯著差異（D Carlander,2002)、B產(chǎn)蛋率和產(chǎn)蛋間歇與IgY濃度、C蛋重及

4、卵黃重、D營養(yǎng)影響免疫系統(tǒng)發(fā)育、免疫機能狀況和生產(chǎn)性能、E健康狀況（SPF雞群，起碼應(yīng)無免疫抑制性疾病和垂直傳播性疾病，對父母代IBD的免疫） （3）免疫途徑、免疫程序、佐劑,續(xù)（3）,6.生產(chǎn)卵黃抗體典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）： (1)首免，胸肌注射0.51mg/羽弗氏完全佐劑等體積乳化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐劑乳化抗原進行24次加強免疫，劑量逐步放大12倍。這種多次注射加強劑量的抗原使之產(chǎn)生較高自動獲得性免疫的過程，稱之為“超免疫作用”。,（三）IgY結(jié)構(gòu)特點,續(xù)（1）,這種差異沒有影響IgY的抗原-抗體結(jié)合特性和結(jié)合能力，結(jié)合價也是2（Wa

5、rr等, 1995），然而對于pH、溫度及蛋白水解等引起構(gòu)象變化的環(huán)境條件，IgY比IgG穩(wěn)定； 由于缺乏鉸鏈區(qū)，兩個抗原結(jié)合片段（Fab）緊密排列，使IgY缺少韌性及功能種類，在確定條件下沉淀及聚合反應(yīng)能力降低（Warr等，1995），這使其具有抵抗幼齡動物胃酸屏障的能力。 3.IgY能介導(dǎo)過敏反應(yīng)，與哺乳動物的IgE相似。,（四） IgY相對IgG的優(yōu)勢,1.高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)對禽有較強的免疫原性，且產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量?。―anielpour.D,1993），如IGF-1，且免疫應(yīng)答快； 2.免疫反應(yīng)具有交叉性，血緣越近，交叉反應(yīng)程度越高；由于結(jié)構(gòu)上差異，IgY 與IgG幾乎

6、沒有交叉免疫反應(yīng)，減少了非特異結(jié)合和假陽性；減少非特異性結(jié)合使免疫學(xué)檢測靈敏性提高（達50%）； 3. IgY具有較強的抗熱、抗酸、抗離子強度和一定的抗酶分解能力（相對于IgG），提純后IgY在合適條件儲存10年滴度沒有損失（Olovson等，1993），幼畜可以口服，經(jīng)保護處理后成年動物也可以口服，提純后可以肌注（孫希琪，1995） ； 4.USDA和FDA認為卵黃抗體是GRAS（generally regarded as safe）且已允許商業(yè)生產(chǎn)用于人；,續(xù)（1）,5.符合動物福利原則。 因此，IgY具有可規(guī)模生產(chǎn)、成本低、特異性抗體含量高、安全性好等優(yōu)點,比實驗室條件下通過實驗動物制備

7、有限的高免血清更有實用性。,（五）IgY純化、活性測定及保存,1.雞蛋儲存在+4條件下6個月IgY活性損失很小。用做食品和飼料添加劑，或獸醫(yī)臨床上，IgY多以全卵黃或其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。 2.用于診斷分析或純化生物活性分子，或在人醫(yī)臨床上則需要提高IgY純度或提純特異性IgY。 IgY純化分三步： 第一步是粗提，將含有IgY的水溶性蛋白與水不溶的脂類和脂蛋白分離，即除去脂質(zhì)；方法有超濾、有機溶劑萃取、以及PEG、SDS沉淀脂蛋白等，經(jīng)粗提的上清液或水溶液中IgY含量占蛋白質(zhì)的15%； 第二步用硫酸葡聚糖鈉等進一步沉淀，提純出純度大于80%的IgY，此時的IgY要低溫或凍干保

8、存；,續(xù)（1）,第三步是精提法：使用凝膠滲透層析、陰離子交換層析或超濾方法進一步純化，獲得純度96%99%的IgY。 3.Akita等建立的水稀釋法：先在微酸條件下用水稀釋卵黃，分離出卵黃蛋白；再用鹽析、超濾、乙醇沉淀、凝膠過濾等進一步純化IgY。 4.特異性抗體采用親合色譜法純化，離子交換層析法濃縮；或用免疫親合法直接從水溶液中提取。 5.普洛瑪格公司的卵黃抗體純化系統(tǒng)（Promegas EGGstract IgY）提供了快速和簡易的IgY分離方法。該系統(tǒng)能在約1小時內(nèi)提取25mg/ml純度75%的IgY。,續(xù)（2）,6.提純方法的選擇取決于IgY產(chǎn)量、純度、費用要求和技術(shù)水平。 7.常用E

9、LISA測定IgY活性。 8.提純后抗體冷凍或凍干保存。50%（w/v）蔗糖能在熱、酸和高壓等加工條件下阻止IgY變性，在不能冷藏或在加工過程中保護IgY活性。 9. 對提純的IgY進行微膠囊化處理能顯著增強起抗胃蛋白酶和胃酸的能力。,二、 IgY應(yīng)用技術(shù),IgY上述優(yōu)勢及其對病原菌感染的防御無動物種屬差 異使其在傳染病的預(yù)防、診斷及治療、免疫抗體監(jiān)測、 免疫分析、酶聯(lián)分析以及做為功能食品因子和抗生素替 代品都很有用，特別是用雞高免卵黃抗體防治其他動物 和人的腸道疾病。,內(nèi)容,（一）在家禽中的應(yīng)用 （二）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用 （三）對仔豬和犢牛腹瀉的防治 （四）在奶牛上的應(yīng)用 （五）在人醫(yī)上的應(yīng)

10、用,（一）在家禽中的應(yīng)用,1.目前國內(nèi)應(yīng)用卵黃抗體防治的禽病有傳染性法氏囊、雞新城疫、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、番鴨細小病毒、雞減蛋綜合征等。 2.用IgY治療IBD和ND混合感染。 3.抗沙門氏菌LPS特異IgY阻止禽蛋和禽肉中沙門氏菌粘附、控制其增殖上發(fā)揮明顯作用（H.H.Sunwoo等，2000）。 4.IgY對雛雞傳染病的預(yù)防有獨到優(yōu)點；用于緊急預(yù)防接種見效快； 5.IgY代替血清抗體對禽傳染病做出診斷和疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測。,（二）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用,1.通過飼料用IgY治療鰻魚愛德華氏菌癥。,（三）IgY對仔豬和犢牛腹瀉的防治,1.幼齡動物消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，吸收初乳的同時口服特異

11、性IgY， 保護作用將顯著增強。這方面應(yīng)用最多的是對仔豬大腸桿菌及仔 豬、羔羊輪狀病毒腹瀉的治療。 2.大腸桿菌導(dǎo)致仔豬腹瀉及抗大腸桿菌菌毛IgY阻止其在小腸粘膜上 附著，體外粘著抑制試驗支持這一假設(shè)（Yokoyama等,1992）。 3.李國平等（2002）證明：仔豬出生后頭36小時內(nèi)口服IgY不被分解， 和注射效果無差異。卵黃抗體與菌毛抗原的親和力遠遠超過母乳 及高免血清中抗體與抗原的親和力，對控制此病極為有利 。 4.如分離自家病原制備IgY用于本豬場腹瀉防治，更有針對性，其效 果優(yōu)于抗生素。,續(xù)（1）,5.卵黃抗體治療仔豬黃痢的效果(肖馳，1997) 注：與其它三組相比，差異極顯著（p

12、0.005） 6.人工攻毒試驗證明，含特異性牛冠狀病毒（BCV）或產(chǎn) 毒素大腸桿菌的卵黃和初乳具有類似防治犢牛腹瀉的 效果。,（四）IgY在奶牛上的應(yīng)用,1.乳房炎給奶業(yè)帶來巨大損失，在美國，1992年乳房炎造成十億美元損失； 3.SCC是衡量乳房感染與否及感染程度的指標(biāo)，主要病原是葡萄球菌和鏈球菌； 4.日糧中特異性抗葡萄球菌和鏈球菌IgY顯著降低了SCC； 5.IgY給量與產(chǎn)奶量和奶中無脂固型物增加相關(guān)； 6.M Coleman(2000推測)，IgY酶解片段（Fab）含9-11個氨基酸，可能不再降解而被吸收進入血液，仍能在循環(huán)中發(fā)揮活性作用。,（五）IgY在人醫(yī)上的應(yīng)用,1.通過口服病原

13、特異性抗體建立人被動免疫保護，特別是對于胃腸道抗原。雞蛋是正常的食物組成，口服IgY沒有毒副作用的風(fēng)險，是人們喜歡的口服免疫治療物品。 2.用抗鏈球菌卵黃抗體漱口能減少鏈球菌在牙齒琺瑯質(zhì)上的定居（Hatta H等，1997），有效預(yù)防齲齒。 3.雖然可以通過遺傳工程設(shè)計出HIV顆粒的許多抗原決定簇，由于HIV不斷變異，使抗HIV抗原決定簇的單克隆治療AIDS病人缺乏長期效果；IgY是多抗，能同時識別幾個位點，提高了結(jié)合HIV顆粒的機會，使免疫系統(tǒng)除去HIV。 4.卵黃抗體保護免疫抑制病人或治療先天性免疫缺陷患兒。 5.IgY作為分泌型IgA的替代物，為免疫抑制病人內(nèi)臟表面提供保護。,續(xù)（1）,6.與抗生素相比，IgY不會產(chǎn)生抗藥性，是安全、有效、廉價的方式。人醫(yī)上用IgY預(yù)防小兒病毒性腹瀉已取得理想的結(jié)果。開發(fā)功能性食品。,三、問題及展望,1.現(xiàn)代免疫技術(shù)、最新生化分離技術(shù)、雞蛋的工業(yè)化