1、1,實驗 1,頰粘膜上皮細(xì)胞基因組DNA的抽提及ACE基因多態(tài)性分析,2,一、實驗?zāi)康?掌握從微量來源的組織細(xì)胞中抽提基因組DNA 掌握PCR技術(shù)原理 了解基因多態(tài)性分析的方法。,3,二、原理,基因組DNA抽提 堿裂解法抽提基因組DNA（本實驗） 用蛋白酶K和苯酚提取大分子DNA 裂解-蛋白酶K-沉淀法快速提取DNA ACE基因多態(tài)性分析 PCR方法分析基因多態(tài)性,4,真核生物基因組中非編碼序列多于編碼序列,基因組,編碼序列,非編碼序列,調(diào)控序列,重復(fù)序列,高重復(fù)序列（串聯(lián)排列，大衛(wèi)星、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星）,中重復(fù)序列（散在分布；部分編碼；Alu家族）,低重復(fù)序列或單拷貝,5,Alu家族 重復(fù)單位

2、：300bp左右；130+31+130bp 具Alu酶切位點 30-50萬次 功能：基因調(diào)控 Alu元件的插入、刪除和重組與許多先天性遺傳疾病和癌癥相關(guān),6,ACE基因多態(tài)性分析(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶, Angiotesin converting enzyme, ACE),基因診斷：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的方法，從DNA、RNA水平檢測基因的存在、結(jié)構(gòu)異常和表達狀態(tài)，從而對疾病做出診斷的方法。 基因多態(tài)性：指在一隨機婚配的群體中，染色體同一基因座位點上有兩種或兩種以上的基因型，它可決定人體對疾病的易感性、臨床表現(xiàn)多樣性和對藥物治療反應(yīng)的差異性。,7,理論基礎(chǔ) ACE基因第16內(nèi)含子存在一段

3、長度為287bp（Alu序列）的插入/缺失（I/D）多態(tài)性片段，I/D多態(tài)性與血液ACE水平有明確關(guān)系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。左室肥大患者中DD型頻率明顯增高。 實驗原理 以DNA為模板，ACE基因特異的引物序列位于287bp插入/缺失片段的兩側(cè)進行PCR擴增，故II型擴增片段長度約為490bp，DD型擴增片段長度約為190bp，ID型擴增片段為個，分別為190bp和490bp。根據(jù)PCR擴增片段的大小可進行多態(tài)性分析。,8,插入片段,插入型,缺失型,9,操作步驟,基因組DNA抽提 PCR反應(yīng) 瓊脂糖凝膠電泳檢測,10,1. 基因組DNA抽提,溶液 10 ml 漱口20秒

4、收集漱口水； 3000g5minRT，棄上清； 溶液 250 ul 重懸沉淀； 3000g1min，棄上清； 溶液 250 ul 重懸沉淀，振蕩10秒；（變性） 轉(zhuǎn)至0.5 ml離心管， 995min； 加溶液IV 50 ul 振蕩5秒；（中和） 3000g1min， 上清轉(zhuǎn)移至新0.5 ml離心管，取5 ul用于PCR.,11,2. PCR反應(yīng),取消毒的0.5 ml離心管，加入下列成分： 10PCR Buffer dNTP(2.5 mM each) mix: 10l Taq DNA polymerase DNA模板 5 l 引物混合物(10M each) 2 l ddH2O 3 l 總體系 20 l 擴增程序為：94變性30s，55復(fù)性30s，72延伸40s，共反應(yīng)35個循環(huán)。,12,瓊脂糖電泳檢測,制備