1、,Chimeric antigen receptor T-cell therapy,CAR-T細(xì)胞治療,目,錄,1,2,3,4,5,6,概述,CAR-T細(xì)胞治療的安全性,CAR-T細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用,CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應(yīng),分子結(jié)構(gòu),CAR-T細(xì)胞治療的流程,7,展望,1. 概述,2011年，美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)June教授研究組報(bào)道了采用抗CD19單抗、4-1BB和TCR/CD3的鏈構(gòu)建嵌合型抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾T細(xì)胞治療3例晚期慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)病例的臨床研究，3例CLL治療后2例達(dá)到完全緩解(已隨訪10和

2、11個(gè)月)，1例為部分緩解1。研究結(jié)果表明抗CD19 CAR在治療B系惡性腫瘤中的良好前景。 在此之后，針對(duì)復(fù)發(fā)和難治B細(xì)胞淋巴瘤/白血病的CAR-T細(xì)胞免疫治療便迅速受到全球淋巴瘤相關(guān)專家和制藥公司的關(guān)注和跟進(jìn)。,1徐曉軍，趙海招，湯永民.嵌合抗原受體技術(shù)免疫治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究進(jìn)展.,1. 概述,1.1 CAR-T細(xì)胞概念 T細(xì)胞是人體內(nèi)發(fā)揮特異性抗腫瘤作用的效應(yīng)細(xì)胞，其作用的發(fā)揮具有主要組織相容性復(fù)合物(main histocompatibility complex, MHC) 限制。 然而, 腫瘤免疫編輯的過(guò)程會(huì)使MHC在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)下降，破壞抗原加工過(guò)程, 降低肽段免疫原性

3、。這樣長(zhǎng)期形成的免疫逃逸機(jī)制, 能使腫瘤細(xì)胞成功躲避T細(xì)胞攻擊, 腫瘤快速增殖。 而人體內(nèi)另一種特異性淋巴細(xì)胞B細(xì)胞的抗原受體及其分泌的抗體可以直接與相應(yīng)的抗原結(jié)合。,1. 概述,1.1 CAR-T細(xì)胞概念 通過(guò)將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)的單鏈抗體(single chain fragment variable，scFv) 和胞內(nèi)信號(hào)域“免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM, 通常為CD3或FcRI)”在體外進(jìn)行基因重組，生成重組質(zhì)粒，再在體外通過(guò)轉(zhuǎn)染

4、技術(shù)轉(zhuǎn)染到患者的T細(xì)胞，使患者T細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原受體,轉(zhuǎn)染后經(jīng)過(guò)純化和大規(guī)模擴(kuò)增后的T細(xì)胞，稱之為嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)。 表達(dá)CAR的T細(xì)胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原, 啟動(dòng)并活化特異性殺傷腫瘤反應(yīng)。,1. 概述,1.2相關(guān)概念 MHC（主要組織相容性復(fù)合體）是由一群緊密連鎖的基因群組成，定位于動(dòng)物或人某對(duì)染色體的特定區(qū)域，呈高度多態(tài)性。其編碼的分子表達(dá)于不同細(xì)胞表面，參與抗原遞呈，制約細(xì)胞間相互識(shí)別及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。 人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復(fù)合體，其編碼的分子表達(dá)于白細(xì)胞上，稱為人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HL

5、A)。 白細(xì)胞分化抗原是白細(xì)胞在正常分化成熟不同譜系和不同階段以及活化過(guò)程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的聚類分析法，將識(shí)別同一分化抗原的來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體歸為一個(gè)分化群或分化抗原簇（cluster of differentiation,CD）。 T細(xì)胞抗原受體( T cell antigen receptor，TCR）是T細(xì)胞特異性識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合體，啟動(dòng)T細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子 。,1. 概述,T cell,Antigen -presenting cell,T細(xì)胞活化的“雙信號(hào)學(xué)說(shuō)”,2. 分子結(jié)構(gòu),圖1 嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)示意圖

6、2,大多數(shù)CAR包括胞外抗原結(jié)合區(qū)(由來(lái)源于單克隆抗體的輕鏈和重鏈組成, 中間由帶韌性的鉸鏈區(qū)連接形成單鏈抗體)、跨膜區(qū)域(一般由同源或異源的CD3、CD8或CD28等二聚體膜蛋白組成)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(免疫受體酪氨酸活化基序, 通常為CD3或FcRI)組成。,2陳杰 ,王宇環(huán) ,羅成林 ,王慧琴 ,羅曉玲.嵌合抗原受體T細(xì)胞介紹及抗腫瘤臨床應(yīng)用.,2. 分子結(jié)構(gòu)嵌合抗原受體的演化,第一代CAR由單鏈抗體通過(guò)跨膜區(qū)域與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)(ITAM)相連, ITAM通常為CD3或FcRI。但第一代CAR設(shè)計(jì)的信號(hào)域是單一的信號(hào)分子，而腫瘤細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)減弱或缺失，所以CAR修飾的T細(xì)胞( C

7、AR-T細(xì)胞) 雖然能識(shí)別腫瘤細(xì)胞，但由于缺乏有力的“第二信號(hào)”，CAR-T細(xì)胞難以充分活化，在體內(nèi)存在時(shí)間短，臨床效果有限 。只能引起短暫的T細(xì)胞增值和較低的細(xì)胞因子分泌，不能提供長(zhǎng)時(shí)間的T細(xì)胞擴(kuò)增信號(hào)和持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。,2. 分子結(jié)構(gòu)嵌合抗原受體的演化,第二代CAR的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)引入了共刺激分子CM1, 主要為CD28分子。依照T細(xì)胞活化的“雙信號(hào)學(xué)說(shuō)”，T細(xì)胞的激活和增殖需要共刺激信號(hào)。 在第1代CAR的基礎(chǔ)上引入1 個(gè)共刺激分子，不僅增加T 細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)而且增強(qiáng)了T 細(xì)胞的抗腫瘤特性。,2. 分子結(jié)構(gòu)嵌合抗原受體的演化,第三代CAR引入了雙共刺激分子(CM1和CM2), 主要

8、為CD28分子加上CD134或CD137。可增強(qiáng)T 細(xì)胞的殺瘤能力，并延長(zhǎng)了T 細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間。第3代CAR在T 細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、體內(nèi)存活時(shí)間以及分泌細(xì)胞因子的能力都較第2代有優(yōu)勢(shì)。,3. CAR-T細(xì)胞治療流程3,3 David M. Barrett, Nathan Singh, David L. Porter, Stephan A. Grupp, and Carl H. June. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer.,4.CAR-T細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用,1. CAR-T細(xì)胞在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中的應(yīng)用 目前正在開發(fā)的針對(duì)血液系統(tǒng)

9、惡性腫瘤的CAR種類很多，主要包括利用抗CD19、抗CD20、抗Kappa輕鏈、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗體構(gòu)建CAR修飾的T細(xì)胞或NK細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤研究，其中以抗CD19、抗CD20單克隆抗體最為熱門。 CD19特異地表達(dá)于B淋巴細(xì)胞及B系腫瘤，是治療B系腫瘤很有潛力的靶點(diǎn)，也是CAR研究中的熱點(diǎn)。在美國(guó)，目前正在開展的應(yīng)用抗CD19單克隆抗體構(gòu)建CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)腫瘤的臨床試驗(yàn)有10余項(xiàng)，其中包括急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL) 、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL) 、非霍奇金淋巴瘤(NHL)等。,4.CAR-T細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用,1徐曉軍，趙海招，湯永民.嵌合抗原受

10、體技術(shù)免疫治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究進(jìn)展.,4.CAR-T細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用,2. CAR-T 細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用 CAR具有賦予T 細(xì)胞更強(qiáng)的靶向性并能打破宿主免疫耐受狀態(tài)等理論優(yōu)勢(shì)，在白血病、淋巴瘤中取得了不錯(cuò)的療效。 現(xiàn)在CAR-T 細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用主要包括卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等。 但由于實(shí)體腫瘤的脫靶效應(yīng)、免疫細(xì)胞不易進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部等因素，該應(yīng)用尚處于臨床前期試驗(yàn)階段。,5.CAR-T細(xì)胞治療的安全性,根據(jù)現(xiàn)有的臨床試驗(yàn)，CAR-T 細(xì)胞輸注的安全性良好，大部分患者能夠耐受。目前對(duì)于CAR-T細(xì)胞治療的擔(dān)憂主要來(lái)自以下幾個(gè)方面：,插入突變2

11、 CAR-T技術(shù)是在T細(xì)胞中插入一段外源DNA片段, 理論上說(shuō)其結(jié)構(gòu)已被破壞, 存在一定的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。雖然目前并沒(méi)有關(guān)于基因改造T細(xì)胞致瘤性的報(bào)道, 但是研究者還是一直在關(guān)注此問(wèn)題， 也在不斷通過(guò)優(yōu)化載體類型和轉(zhuǎn)染方式來(lái)降低插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，某些研究中心已采用mRNA直接轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的辦法以避免該風(fēng)險(xiǎn)。,01,02,5.CAR-T細(xì)胞治療的安全性,脫靶效應(yīng)（off-target effect） 用于腫瘤治療的多數(shù)靶抗原在人體正常組織中也會(huì)有微量的表達(dá)，所以對(duì)靶抗原親和力強(qiáng)殺傷能力強(qiáng)的CAR-T與這類抗原作用勢(shì)必造成組織損傷，即為脫靶效應(yīng)。 腫瘤抗原分為腫瘤特異性抗原( tumor specific

12、antigen，TSA) 和腫瘤相關(guān)抗原( tumor associated antigen，TAA) 。TSA 只表達(dá)于腫瘤細(xì)胞而不表達(dá)于正常細(xì)胞的抗原。TAA 是指一類既表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，也表達(dá)于正常細(xì)胞的抗原。研究者首先考慮的是 TSA。但目前已知的TSA較少, 除了少數(shù)CAR-T試驗(yàn)外, 大多數(shù)針對(duì)重要組織不表達(dá)或相對(duì)可損耗組織表達(dá)的TAA。 因此，在采用該手段治療時(shí)，必須個(gè)體化地權(quán)衡利弊。同時(shí)應(yīng)盡量研發(fā)和采用特異性強(qiáng)的抗原。,03,5.CAR-T細(xì)胞治療的安全性,炎癥反應(yīng) CAR-T細(xì)胞輸注后在體內(nèi)腫瘤抗原的刺激下活化，分泌大量IL-6、IFN-和TNF-等炎癥因子，形成細(xì)胞因子釋放綜

13、合征，致使臟器損傷。此外，腫瘤細(xì)胞大量破壞后也可能出現(xiàn)腫瘤溶解綜合征及腎功能損害等表現(xiàn)。,6.CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應(yīng),6.1 B細(xì)胞發(fā)育不全（B-cell aplasia4） 以CD19、CD20為靶抗原的CAR-T治療B細(xì)胞惡性腫瘤時(shí)，B細(xì)胞發(fā)育不全是CD-19定向療法的預(yù)期結(jié)果，以CD19、CD20為靶抗原的CAR-T治療在高效殺傷惡性B細(xì)胞的同時(shí)也殺傷機(jī)體內(nèi)其他B細(xì)胞，導(dǎo)致患者長(zhǎng)期處于免疫功能低下?tīng)顟B(tài)。但可作為CD-19定向CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活和有效性的指標(biāo)。 B細(xì)胞發(fā)育不全可以注射丙球蛋白作為補(bǔ)充治療。持續(xù)的B細(xì)胞發(fā)育不全即使使用替代療法也可能導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)的增

14、加。 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)消失后B細(xì)胞可以恢復(fù)，因此患者可以再接受CAR-T細(xì)胞。,4 Sara Ghorashian,1Martin Pule,and Persis Amrolia. CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy for haematological malignancies.,6.CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應(yīng),6.2 細(xì) 胞 因 子 釋 放 綜 合 征（cytokine release syndrome，CRS） 概念5：淋巴細(xì)胞在應(yīng)用單克隆抗體、細(xì)胞因子等治療或感染后出現(xiàn)活化、溶解，并釋放出大量細(xì)胞因子所導(dǎo)致的

15、一組臨床綜合征。 臨床癥狀：發(fā)熱、乏力、頭痛、惡心、心動(dòng)過(guò)速、低血壓、皮疹、呼吸急促等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能衰竭或者急性呼吸窘迫綜合征。 機(jī)制：CRS發(fā)生發(fā)展與CAR結(jié)構(gòu)、腫瘤類負(fù)荷及類型以及患者基因多態(tài)性等相關(guān)，可通過(guò)設(shè)計(jì)安全的CAR或CAR-T細(xì)胞并嚴(yán)格限制每次輸注的細(xì)胞數(shù)量來(lái)降低CRS發(fā)生。 糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞因子拮抗劑具有降低CRS相關(guān)死亡的作用。,5錢軍，周俊東，鄒志宏.細(xì)胞因子釋放綜合征的發(fā)生機(jī)制和防治策略.,6.CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應(yīng),6.2 細(xì) 胞 因 子 釋 放 綜 合 征（cytokine release syndrome，CRS） Davila等6在

16、觀察及處理16例白血病患者不良反應(yīng)后， 總結(jié)出了糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。 即嚴(yán)重CRS的診斷：（1）發(fā)熱至少連續(xù)3天；（2）出現(xiàn)兩種細(xì)胞因子分泌量至少增加75倍，或者一種細(xì)胞因子增加250倍；（3）至少出現(xiàn)下述1種臨床毒性反應(yīng) ：低血壓、低氧血癥（PO2 90%）、神經(jīng)系統(tǒng)異常（包括精神狀態(tài)改變、 思維遲滯 、癲癇）。,6 Marco L. Davila et al.Efficacy and Toxicity Management of 19-28z CAR T Cell Therapy in B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia.,6.CAR-T細(xì)胞治療血液系

17、統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應(yīng),6.3 CAR-T相關(guān)腦病（ Encephalopathy） 癥狀：失語(yǔ)、意識(shí)模糊、精神錯(cuò)亂、譫妄、幻覺(jué)、癲癇等。具有自限性，持續(xù)2-3天。 發(fā)生機(jī)制：尚不明確。與CRS的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，與是否應(yīng)用塔西單抗無(wú)關(guān)。 發(fā)生時(shí)機(jī)：通常發(fā)生在細(xì)胞因子釋放綜合征的癥狀達(dá)到頂峰之后?？砂l(fā)生在高熱期間或熱退之后。 輔助檢查：CT、MR等檢查可無(wú)異常。腦脊液中的CD19CAR-Tcell檢測(cè)可能存在意義。,7Shannon L. Maude, M.D., Ph.D., etc.Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remission

18、s in Leukemia,誘人的應(yīng)用前景,尋找其他分子靶點(diǎn),提高CAR有效性和安全性,CAR修飾的T細(xì)胞腫瘤免疫治療理論上的優(yōu)勢(shì)和臨床前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,尋找腫瘤特異性抗原作為分子靶點(diǎn)和開發(fā)適合CAR的單鏈抗體,優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)，篩選出良 好治療潛質(zhì)的T細(xì)胞亞群,隨著研究的不斷深入，相信 不久的將來(lái)CAR修飾T細(xì)胞 會(huì)給腫瘤治療帶來(lái)新的希望,展望,展望,參考文獻(xiàn),1徐曉軍，趙海招，湯永民.嵌合抗原受體技術(shù)免疫治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究進(jìn)展. 2陳杰 ,王宇環(huán) ,羅成林 ,王慧琴 ,羅曉玲.嵌合抗原受體T細(xì)胞介紹及抗腫瘤臨床應(yīng)用. 3 David M. Barrett, Nathan Singh,

19、David L. Porter, Stephan A. Grupp, and Carl H. June. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. 4 Sara Ghorashian,1Martin Pule,and Persis Amrolia. CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy for haematological malignancies. 5錢軍，周俊東，鄒志宏.細(xì)胞因子釋放綜合征的發(fā)生機(jī)制和防治策略. 6 Marco L. Davila et al.Efficacy and Toxicity Management of 19-28z CAR T Cell Therapy in B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. 7Shannon L. Maude, M.D., Ph.D., etc.Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remis