1、雞致病性大腸桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏實驗實驗基本步驟：樣品肝、脾觸片革蘭氏染色鏡檢普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板分離培養(yǎng)革蘭氏染色鏡檢、生化實驗鑒定普通肉湯培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)藥敏實驗。1 病料采集1.1 準(zhǔn)備材料：試管、載玻片、手術(shù)刀、手術(shù)剪、結(jié)扎繩、記號筆、冰塊、泡沫箱、口罩、手套（該滅菌的都進(jìn)行高壓蒸汽滅菌）、冰箱。1.2 取材部位：血液、肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物，若有雞胚感染則去雞胚及卵黃物。1.3 操作方法：將病死雞浸泡在消毒劑溶液中，打開腹腔，無菌采集肝臟、脾臟放于事先準(zhǔn)備好的滅菌試管內(nèi)，將帶有腸內(nèi)容物的腸管兩端結(jié)扎放于滅菌是試管內(nèi)。將有明顯病變的臟器入肝、脾進(jìn)行觸片，做好標(biāo)記。都貼上標(biāo)簽，標(biāo)示采

2、集樣品，來源地，采集時間，采集人。將裝有病料的試管放在放有冰袋的泡沫箱中，及時返回實驗室，置于4冰箱待檢。2 菌的分離培養(yǎng)及鑒定2.1 準(zhǔn)備材料：光學(xué)顯微鏡、革蘭氏染色液、載玻片、手術(shù)刀、接種環(huán)、平皿、恒溫箱、高壓鍋、搖床、酒精燈、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化發(fā)酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、VP指示劑、超凈臺。培養(yǎng)基：A. 普通瓊脂培養(yǎng)基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化鈉 5g、瓊脂 20g、蒸餾水1000ml，ph7.30.1），B

3、. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨20g、牛膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂15g，乳糖10g、結(jié)晶紫0.001g、中性紅0.025g，ph7.20.2。），C. 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化鈉 5g、蒸餾水1000ml，ph7.20.2）。22 樣品觸片鏡檢涂片鏡檢：取觸片,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。2.2.1在玻片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，作用1min，水洗。2.2.2 加革蘭氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。2.2.3再加95%酒精脫色，作用1530s，水洗；加番紅復(fù)染液復(fù)染1min，水洗，自然干燥后鏡檢，觀察細(xì)菌染色與形態(tài)。結(jié)果鑒定：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色?？?/p>

4、見革蘭氏陰性,兩端鈍圓、無芽胞、單個散在的短桿菌。2.3 菌的分離培養(yǎng)以無菌操作的方法，將滅菌后的外科手術(shù)刀片燒烙臟器被膜后，再用接種環(huán)刺入臟器實質(zhì)取樣做分離培養(yǎng)。分別接種在普通瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，37恒溫培養(yǎng)24h，然后觀察，同時進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果鑒定：在普通瓊脂平板上生長菌落較為一致,直徑2 mm左右,菌落呈圓形、凸起、濕潤、半透明、灰白色;在麥康凱平板上生長出紅色、中等大小、圓形的菌落。2.4 革蘭氏染色鏡檢 用接種環(huán)挑取一環(huán)生理鹽水蘸于潔凈玻片上，再用接種環(huán)挑取少量麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)2O h的新鮮菌落,光滑、磚紅色的單個菌落與玻片上的生理鹽水混合，并均勻涂布于玻片上，將涂

5、片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果鑒定：經(jīng)鏡檢可見到呈紅色的革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓，短小桿菌，偶有23個菌體相連，無芽孢。2.5 生化鑒定a、糖發(fā)酵試驗 取可疑菌分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖發(fā)酵管，37培養(yǎng)23d，觀察各管產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。 b、甲基紅（MR）試驗 取可疑菌接種葡萄糖蛋白胨水，37培養(yǎng)23d，加入甲基紅試劑兩滴，立即觀察結(jié)果，紅色者為陽性，黃色者為陰性。c吲哚試驗 取可疑菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，3

6、7培養(yǎng)23d。先加入3-4滴乙醚，塞緊棉塞振搖試管，使乙醚與培養(yǎng)液充分混勻，靜置試管架上片刻，待乙醚浮于液面上層時，沿管壁加入吲哚試劑23滴，在接觸面呈紅色者即為陽性反應(yīng)。dVP試驗 取可疑菌接種葡萄糖蛋白胨水，37培養(yǎng)23d，加入VP指示劑，混勻后觀察結(jié)果，呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。結(jié)果鑒定：a.糖發(fā)酵試驗，大腸桿菌能利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而蔗糖則不被利用。 b.甲基紅試驗：陽性。 c.吲哚試驗：陽性。 d.VP試驗：陰性。2.6 菌的增殖培養(yǎng)挑取普通瓊脂平板中表面生長光滑、邊緣整齊、灰白色、半透明的單個微隆起小菌落，劃線接種于普通肉湯中，在37恒溫培養(yǎng)24h5。

7、結(jié)果鑒定：肉湯呈均勻渾濁，管底有灰白色沉淀，并有糞臭味。3 藥敏實驗3.1 準(zhǔn)備材料：測試藥、生理鹽水、濾紙、青霉素空瓶、酒精燈、接種環(huán)。普通瓊脂平板培養(yǎng)基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化鈉 5g、瓊脂 20g、蒸餾水1000ml，ph7.30.1）、平皿、超凈臺、恒溫箱。3.2 藥敏片的制備3.2.1藥液的制備：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。 3.2.2 紙片的制備：取濾紙，用打孔機(jī)打成圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37烘箱中數(shù)天，使完全干燥。 3.2.3抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。 3.3 藥敏實驗在無菌條件下將培養(yǎng)24h的肉湯培養(yǎng)物，用滅菌生理鹽水作10倍稀釋，取0.2mL滴加在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，用滅菌棒涂勻，平板置室溫下干燥35min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，等距離放置