1、流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析目的就是需要確定所要研究的目的細(xì)胞器，這就涉及到設(shè)門。設(shè)門就是劃定某一區(qū)域的細(xì)胞群體，對(duì)其單獨(dú)加以分析或分選。門的形狀可任意，方法有幾種：（1）閾值設(shè)門。FSC（前向散射光）是最常用的閾值參數(shù)。FSC 和細(xì)胞的大小正相關(guān)。用FSC 設(shè)閾值，可以使低于該閾值的細(xì)胞碎片等其他雜質(zhì)的信號(hào)不被處理。（2）散射光設(shè)門。以FSC 和SSC（側(cè)向散射光）聯(lián)合設(shè)門較常用。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以排除碎片或噪聲的干擾?？梢愿鶕?jù)FSC vs SSC 散點(diǎn)圖上不同細(xì)胞分布不同來設(shè)門目的細(xì)胞群。另外還有熒光設(shè)門、反向設(shè)門和組合設(shè)門。流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。應(yīng)該注意到設(shè)門是一個(gè)主觀

2、行為，是人為做出的決定，不同的人設(shè)門會(huì)存在很大差異，它是流式細(xì)胞術(shù)中最難掌握的技術(shù)。因此，對(duì)設(shè)門有2 點(diǎn)需要把握：首先，設(shè)門盡可能客觀；其次，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到設(shè)門需要主觀決策。為了盡量減少主觀判斷帶來的誤差，最好分選一些細(xì)胞用顯微鏡觀察來進(jìn)一步確認(rèn)門的客觀性和準(zhǔn)確性。流式細(xì)胞術(shù)的設(shè)門的注意事項(xiàng)：通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞樣品時(shí)，欲獲得更加準(zhǔn)確的分析結(jié)果，應(yīng)用最優(yōu)化的設(shè)門策略非常重要。要考慮的因素包括：1）排除細(xì)胞碎片2）應(yīng)用合適的熒光陰性對(duì)照3) 排除死細(xì)胞. 4) 如果合適，使用一種共享標(biāo)記物（比如CD45白細(xì)胞標(biāo)記或與之等效的泛-細(xì)胞群標(biāo)記）染色5） 設(shè)置必需的熒光分析點(diǎn)圖1）去除細(xì)胞碎片:在流式細(xì)

3、胞儀上獲取數(shù)據(jù)時(shí)，建立一個(gè)前向散射（FSC）VS. 側(cè)向散射（SSC）點(diǎn)圖，并通過調(diào)節(jié)各個(gè)光電倍增管裝置以確定所有要分析的細(xì)胞群都在點(diǎn)圖的可視范圍內(nèi)。在必要時(shí)，需要通過設(shè)置和調(diào)節(jié)FSC閾值，將大部分的細(xì)胞碎片、氣泡和激光背景噪的干擾排除在分析區(qū)域之外（都應(yīng)該設(shè)在FSC-low的區(qū)域）。接下來，在FSC vs SSC點(diǎn)圖中圈出感興趣的細(xì)胞群的周圍區(qū)域（R1），這個(gè)區(qū)域可以被稱為“R1-FSC vs SSC”。 （裂解后的人全血FSC vs SSC 的典型設(shè)置）2) 應(yīng)用合適的熒光陰性對(duì)照：染細(xì)胞時(shí)，建議您將細(xì)胞分在兩個(gè)試管中，在其中一個(gè)試管中，用熒光標(biāo)記的抗體染感興趣的細(xì)胞，而另一個(gè)試管應(yīng)用熒光

4、同型抗體做為相應(yīng)的陰性對(duì)照，這樣有助于在分析中更精確地區(qū)分陽性信號(hào)和陰性的熒光背景。3) 排除死細(xì)胞：通過Propidium Iodide (PI)或7-AAD等檢測細(xì)胞活性的標(biāo)記染細(xì)胞，以區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。首先建立FSC vs“細(xì)胞活性染色”點(diǎn)圖，然后將 “Region 1-FSC vs SSC”設(shè)置在這個(gè)點(diǎn)圖上。 之后，圈出活細(xì)胞群區(qū)域，稱為“Region 2-Viable” 4) 如果合適，使用一種共享標(biāo)記物染色有時(shí)候，可以染一種在感興趣的細(xì)胞與其他細(xì)胞都有表達(dá)的標(biāo)記（例如在所有白細(xì)胞上都表達(dá)的CD45，）。雖然這個(gè)步驟不是必須的，但對(duì)于分析一些稀少細(xì)胞類型時(shí)有幫助。首先，建立一個(gè)FSC vs “共享標(biāo)記物”的點(diǎn)圖，將“Region 2-Viable”設(shè)置于這個(gè)點(diǎn)圖上。然后，圈出所有表達(dá)這個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞群，設(shè)為“Region 3 - Shared Marker”。 5) 設(shè)置必需的熒光分析點(diǎn)圖, 現(xiàn)在可以根據(jù)需要建立熒光分析點(diǎn)圖（例如，F(xiàn)SC vs FITC 或FITC vs PE,等等）。確保將“Region 1 - FSC vs SSC”，“Region 2 Viable”，和“Region