斑馬魚的性腺發(fā)育,精巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞形態(tài),精巢一對，位于腹腔背部兩側(cè)，體積較小，以系膜與體壁相聯(lián)，左右精巢彼此分開，在尾端合并成一條很短的輸精管，和一般鯉科魚類相同。 生殖上皮隨著結(jié)締組織向精巢內(nèi)部延伸，形成許多隔膜，把精巢分成許多不規(guī)則的精小葉，從其橫切面上可見許多精小葉緊密排列，但沒有一定的規(guī)律性，精小葉為精巢的實(shí)質(zhì)部分，因其呈管狀又可稱為精小管。 在精小葉內(nèi)由許多精小囊組成，隨著精巢的發(fā)育，精小葉內(nèi)各精小囊間生精細(xì)胞發(fā)育不同步，而在同一精小囊內(nèi)生精細(xì)胞發(fā)育是同步的。 精小葉中央為小葉腔，小葉腔在精巢內(nèi)相互連接成網(wǎng)狀，最后通到輸精管，精原細(xì)胞位于精小葉的邊緣處，在分化過程中，當(dāng)生殖細(xì)胞在精小囊內(nèi)發(fā)育成為成熟的精子時(shí)，精小囊破裂，成熟的精子釋放到小葉腔中，各小葉腔內(nèi)的精子最后匯集到輸精管內(nèi)并可借助于輸精管排出，因此成熟的精子只在小葉腔和輸精管內(nèi)存在。 生殖細(xì)胞在發(fā)生上由外向里可分為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。,繁殖期，V 期精巢,III 期精巢；小葉腔明顯，初級精母細(xì)胞排列多層，比例尺示 24m,Sg,精原細(xì)胞；Sc,初級精母細(xì)胞；Sc，次級精母細(xì)胞；St,精子細(xì)胞；Sz,精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細(xì)胞；SC,支持細(xì)胞；ST,精小囊,VI 期晚期精巢, 示精小囊內(nèi)發(fā)育同步的各期生殖細(xì)胞，比例尺示 24m,Sg,精原細(xì)胞；Sc,初級精母細(xì)胞；Sc，次級精母細(xì)胞；St,精子細(xì)胞；Sz,精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細(xì)胞；SC,支持細(xì)胞；ST,精小囊,V 期早期精巢，示精原細(xì)胞，精母細(xì)胞，精子細(xì)胞和精子，比例尺示 24m,Sg,精原細(xì)胞；Sc,初級精母細(xì)胞；Sc，次級精母細(xì)胞；St,精子細(xì)胞；Sz,精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細(xì)胞；SC,支持細(xì)胞；ST,精小囊,V 期中期精巢，示成熟的精子充滿整個(gè)精小葉，比例尺示 24m；,Sg,精原細(xì)胞；Sc,初級精母細(xì)胞；Sc，次級精母細(xì)胞；St,精子細(xì)胞；Sz,精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細(xì)胞；SC,支持細(xì)胞；ST,精小囊,期精巢，示精子排出后留下的空腔，腔內(nèi)有少量殘存的精子和第二次發(fā)育由精原細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的初級精母細(xì)胞.,Sg,精原細(xì)胞；Sc,初級精母細(xì)胞；Sc，次級精母細(xì)胞；St,精子細(xì)胞；Sz,精子；LL，小葉腔；LC，間質(zhì)細(xì)胞；SC,支持細(xì)胞；ST,精小囊,卵巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞形態(tài),斑馬魚卵巢一對，左右兩葉，大部分對稱；成熟卵巢呈囊狀，位于體腔內(nèi)，外被由平滑肌和結(jié)締組織形成的卵巢膜，卵巢膜不發(fā)達(dá)。 卵巢位于腹中線兩側(cè) ,在魚體后端匯合成一短的輸卵管 ,進(jìn)入泄殖腔,由泄殖腔開口于體外。 卵母細(xì)胞直徑、核徑和核質(zhì)比在不同時(shí)相中的變化:,卵母細(xì)胞在時(shí)相增長不明顯，在、時(shí)相期增長迅速 胞核的直徑在時(shí)相增長迅速，在時(shí)相中期、時(shí)相增長緩慢，幾乎沒有變化 核質(zhì)比在第時(shí)相最大，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，核質(zhì)比越來越小,卵巢壁: 由兩層被膜構(gòu)成 ,外層為腹膜 ,內(nèi)層為白膜。白膜由外到內(nèi)依次為扁平上皮細(xì)胞、 疏松結(jié)締組織、 間質(zhì)組織和生殖上皮。 產(chǎn)卵板: 白膜中的結(jié)締組織向卵巢內(nèi)部伸展與卵巢生殖上皮共同構(gòu)成板層狀結(jié)構(gòu) ,稱產(chǎn)卵板 ,是卵子產(chǎn)生的地方。 卵巢腔: 存在于卵巢內(nèi)部的空腔 ,與輸卵管相通。,S B 產(chǎn)卵板,不同齡雌魚卵巢發(fā)育,016日齡: 沒有觀察到性腺發(fā)育情況。 1722日齡: 原始生殖細(xì)胞沒有兩性分化 ,數(shù) 量開始增多 ,并逐漸聚集成團(tuán) ,細(xì)胞質(zhì)嗜酸性 ,核較大 ,嗜堿性 ,有一明顯核仁。 27日齡: 原始生殖細(xì)胞分化為卵原細(xì)胞 ,體積變大 ,數(shù)量增多 ,成排排列 ,在腹腔后背部分布 ,與肝胰臟相連。 3257日齡: 卵巢體積較小 ,位于腹腔后背部 ,靠近肝胰臟。卵巢內(nèi)主要為第 時(shí)相卵母細(xì)胞 ,細(xì) 胞體積小 ,圓形 ,細(xì)胞質(zhì)少 ,有一明顯細(xì)胞核。核中部有 12個(gè)核仁 ,核內(nèi)染色質(zhì)細(xì)絲狀 。 62日齡: 主要為第 時(shí)相卵母細(xì)胞 ,細(xì)胞為多角形、 圓形。細(xì)胞質(zhì)較多 ,染色較深 ,為淡紫紅色。 核相應(yīng)增大 ,弱嗜酸性 ,核仁數(shù)個(gè) ,靠近核膜內(nèi)側(cè)分布。卵母細(xì)胞外面有一層濾泡細(xì)胞。 6772日齡: 卵巢粗短 ,主要存在第 時(shí)相和發(fā)育早期的第 時(shí)相卵母細(xì)胞。早期第 時(shí)相卵母細(xì)胞比第 時(shí)相卵母細(xì)胞體積大 ,圓形或橢圓形 ,染色較淺 ,核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量空泡。細(xì)胞核較大 ,弱嗜酸性 ,核仁多個(gè) ,分布在核膜內(nèi)緣 ,被染成深藍(lán)色。卵母細(xì)胞外周輻射帶很薄 ,結(jié)構(gòu)不明顯 ,細(xì)胞外隱約能看到兩層濾泡膜。,77日齡: 以第 、 時(shí)相卵母細(xì)胞為主 ,大部分第 時(shí)相卵母細(xì)胞處于發(fā)育中期。中期第 時(shí)相卵母細(xì)胞近圓形 ,體積明顯增大。胞質(zhì)的空泡內(nèi)出現(xiàn)了嗜酸性的卵黃顆粒 ,越靠近細(xì)胞核 ,卵黃顆粒越大。卵核體積增大 ,染色較淺 ,核仁多個(gè) ,分布在核膜內(nèi)緣。隨卵母細(xì)胞的發(fā)育 ,核仁逐漸向核中央移動(dòng) ,呈深藍(lán)色。細(xì)胞周圍輻射帶明顯 ,并隨著細(xì)胞體積的增大而增厚 ,細(xì)胞外兩層濾泡膜發(fā)育明顯 。 8290日齡:以第 、 第 時(shí)相卵母細(xì)胞為主。晚期第 時(shí)相卵母細(xì)胞體積較大 ,空泡內(nèi)充滿卵黃。第 時(shí)相卵母細(xì)胞由于卵黃物質(zhì)不斷積累 ,細(xì)胞體積繼續(xù)增大 ,圓球形的卵黃顆?；境錆M卵母細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核逐漸由中央向動(dòng)物極移動(dòng)。卵巢壁隨卵母細(xì)胞的數(shù)量增多和體積增加而逐漸變薄 ,放射帶明顯增厚。 成熟小魚: 卵巢白膜變得很薄。卵巢以第 時(shí)相卵母細(xì)胞為主 , 也存在有發(fā)育早期的卵母細(xì)胞。第 時(shí)相卵母細(xì)胞已充分發(fā)育 , 呈圓球形 , 卵黃顆粒相互融合 , 細(xì)胞質(zhì)中充滿粗大的卵黃顆粒 , 散布于整個(gè)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。至此 , 卵母細(xì)胞發(fā)育成熟 , 不久 , 核膜崩解、消失 , 卵母細(xì)胞進(jìn)入第 2次成熟分裂中期 , 形成次級卵母細(xì)胞 ,排到卵巢腔。 產(chǎn)卵后小魚:卵巢細(xì)長 ,結(jié)構(gòu)松散 ,包含有排卵后的空濾泡、 第 時(shí)相、 第 時(shí)相和第 時(shí)相卵母細(xì)胞。,1 時(shí)相卵母細(xì)胞 (皮層濾泡期或卵黃生成前期),主要是處在小生長期的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞直徑在約為54.5694.24m，核徑約為29.7659.52m，核質(zhì)比約為：0.110.42。核形不規(guī)則，呈圓形、橢圓形或多角形，細(xì)胞質(zhì)嗜堿性，H. E 染色呈深紫色，核淺藍(lán)色，位于細(xì)胞中央。在同一切面上核內(nèi)有 3-10 個(gè)核仁，沿核膜內(nèi)緣分布。根據(jù)卵徑大小和結(jié)構(gòu)形態(tài)的不同，這個(gè)時(shí)相又可以分為三個(gè)階段；在早期，卵母細(xì)胞形態(tài)仍然不規(guī)則，形狀多變；在發(fā)育中期，卵母細(xì)胞呈近圓球形；發(fā)育晚期，卵母細(xì)胞內(nèi)生長環(huán)迅速擴(kuò)大。濾泡膜僅一層。,時(shí)相卵母細(xì)胞(卵黃生成期),主要是處在大生長期早期的初級卵母細(xì)胞。第 3 時(shí)相卵母細(xì)胞比第 2 時(shí)相卵母細(xì)胞大，但染色要淺。卵母細(xì)胞呈圓球形，該時(shí)相卵母細(xì)胞開始出現(xiàn)液泡，內(nèi)含物被 H. E 染成淡紅色。濾泡膜上皮細(xì)胞開始分裂，并與卵母細(xì)胞的質(zhì)膜分離，出現(xiàn)不明顯的放射帶。根據(jù)卵母細(xì)胞的大小、卵黃沉積的多少以及放射膜的有無將其分為早、中、晚三個(gè)時(shí)期。,時(shí)相早期,卵母細(xì)胞直徑在約為 97.3155.68m 之間，核徑約為 38.9268.11m，核質(zhì)比約為：0.020.14。胞質(zhì)弱嗜堿性。核質(zhì)嗜酸性，核仁位于核膜內(nèi)緣，主要為小核仁，35 個(gè)左右。細(xì)胞質(zhì)外緣出現(xiàn)少許小液泡，直徑 12m，較透明，內(nèi)含物極少。卵母細(xì)胞外周的放射帶很薄，結(jié)構(gòu)不明顯。此時(shí)已經(jīng)形成兩層膜結(jié)構(gòu)。,時(shí)相中期,卵母細(xì)胞明顯增大，卵母細(xì)胞直徑在約為 124198.4m，胞核約 49.6119.04m，核質(zhì)比為 0.030.36。核質(zhì)被染成淺紫色，大核仁少見，小核仁約 40 個(gè)左右，其中較大的分布于核膜內(nèi)側(cè)，較小的散在于核質(zhì)中。放射帶發(fā)育明顯。內(nèi)層膜的細(xì)胞呈立方形，而外層的仍為扁平形。,時(shí)相晚期,卵母細(xì)胞增大為 145.95330.82m，核徑為 48.6558.38m，核質(zhì)比 0.0060.06。液泡充滿卵黃，放射帶的外周形成均染粉紅色的膠質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，小核仁 45 個(gè)左右，多位于核膜內(nèi)側(cè)周邊。,IV 時(shí)相卵母細(xì)胞 (卵母細(xì)胞成熟期),主要是處在大生長期晚期的初級卵母細(xì)胞。由于卵黃物質(zhì)不斷積累，卵母細(xì)胞細(xì)胞體積繼續(xù)增大、卵黃迅速積累、液泡被積壓到卵母細(xì)胞周邊的細(xì)胞質(zhì)中，圓球形的卵黃顆粒基本充滿卵母細(xì)胞質(zhì)，卵母細(xì)胞直徑在約為 379.47447.58m，胞核約 38.9268.11m，核質(zhì)比為 0.00070.004，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核開始由中央直接移向動(dòng)物極移動(dòng)，卵母細(xì)胞開始表現(xiàn)出極性。放射帶明顯增厚。,V 時(shí)相卵母細(xì)胞 (成熟卵期),卵母細(xì)胞已充分發(fā)育，呈圓球形，卵徑約為 467.04564.34m。卵黃顆粒相互融合，細(xì)胞質(zhì)中充滿粗大的卵黃顆粒，卵黃顆粒散布于整個(gè)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，至此，卵母細(xì)胞已經(jīng)成熟，以后便脫離濾泡膜而排入卵巢腔。,2.2.2.5 VI 時(shí)相卵母細(xì)胞,卵細(xì)胞排出，剩余的空濾泡膜，形狀不規(guī)則，蜷曲于卵巢內(nèi)。,斑馬魚的繁殖,斑馬魚為研究脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的理想模式生物,子代數(shù)多 可以光周期誘發(fā)產(chǎn)卵 體外受精，胚體透明，胚胎發(fā)育快 可以誘發(fā)產(chǎn)生突變種 可以分子生物技術(shù)控制特定基因表現(xiàn)或產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)殖魚 在胚胎發(fā)育時(shí)期的訊號傳遞路徑和哺乳動(dòng)物有很高的同源性,分辨斑馬魚雌雄,公魚：與性成熟前體態(tài)相似，保持原本的 流線型，臀鰭較母魚長。在身上各 個(gè)魚鰭末端，時(shí)常可看到有明顯的 黃色出現(xiàn)。 母魚：性成熟后肚子開始膨大，里面卵囊 形成卵，臀鰭較公魚來得小、短且 較圓，魚鰭末端有時(shí)也有黃色出 現(xiàn)，但相對于公魚出現(xiàn)的時(shí)間比較 少。,步驟一、布置環(huán)境,光周期調(diào)控：斑馬魚需要在約14:10光照周 期下，才會(huì)產(chǎn)生交配產(chǎn)卵的 行為。 水溫：需在2428.5。 在適當(dāng)?shù)乃疁叵?，將公魚和母魚分缸進(jìn)行飼養(yǎng)約5-7天后，即可在光周期天亮后1小時(shí)內(nèi)，看到斑馬魚進(jìn)行交配行為。,步驟二、交配前準(zhǔn)備,產(chǎn)卵前一天的準(zhǔn)備： 挑選出適當(dāng)?shù)墓~跟母魚，體長要盡量一樣，母魚可以略大一些。 將公魚與母魚分別放置產(chǎn)卵缸的兩側(cè)，中間設(shè)置隔板將其隔開。 產(chǎn)卵房的準(zhǔn)備,放入隔板及斑馬魚,上盒與普通下盒組裝,上盒底以網(wǎng)狀材料代替,產(chǎn)卵房的準(zhǔn)備,避免剛產(chǎn)出的魚卵被成魚吃掉，而有的特殊設(shè)計(jì)！,1,2,3,4,步驟三、交配當(dāng)天,光周期控制的隔天清晨，當(dāng)天亮后約十分鐘，公魚和母魚會(huì)恢復(fù)清醒。 當(dāng)母魚發(fā)現(xiàn)公魚時(shí)，由于前一天的費(fèi)洛蒙影響，母魚在天亮后也釋放另一種費(fèi)洛蒙，使公魚往母魚方向前去的行為更加明顯及強(qiáng)烈。 此時(shí)就可以準(zhǔn)備打開隔板，讓公魚跟母魚進(jìn)行交配。,交配中,公魚在交配的過程中，采絕對主動(dòng)方式，會(huì)先以眼睛觀察并決定要向哪一只母魚進(jìn)行攻勢。其次會(huì)進(jìn)行求偶舞蹈，在想要交配的母魚周圍繞圈圈或是字型，游向母魚后，利用腹部側(cè)面摩擦母魚，刺激母魚排卵，公魚便會(huì)同時(shí)射精。,產(chǎn)卵,母魚會(huì)一次把全部腹中的卵包括卵囊全部排出，一胎約會(huì)生出200-500顆卵。排出后母魚會(huì)重新產(chǎn)生新的卵，約3-5天就可以再生下一次卵。 伴隨著卵的釋放，會(huì)有其他激素一起排出，這種激素可以讓母魚順利把卵排放出來，另外一個(gè)功能則是讓其他還產(chǎn)生卵的母魚，停止排卵的行為，這在演化上算是一種競爭的結(jié)果。,注意事項(xiàng)（1）,母魚體內(nèi)的卵，如果太長時(shí)間沒有交配，或是沒有完全排完，卵會(huì)留在體內(nèi)，并不會(huì)重新被吸收回去，如果超過太久沒有排卵，母魚腹部中的卵會(huì)死亡，并且造成母魚腹部類似囊腫的殘留物，這種囊腫會(huì)讓母魚下次排卵不順，甚至無法排卵而被公魚激烈的追求之后而難產(chǎn)死亡，目前也沒有較好的方式改善這種情況。一般認(rèn)為，固定一段時(shí)間就讓公魚跟母魚進(jìn)行交配，讓母魚把卵排出，是較好的方式。,注意事項(xiàng)（2）,斑馬魚的卵在受精后，約72小時(shí)即可孵化，在這段期間內(nèi)，不需要給予打氣，只要放在干凈的水中即可孵化。放在解剖顯微鏡下，即可清楚的看到斑馬魚胚胎發(fā)育的整個(gè)經(jīng)過。,人工受精,將魚放入冰水中，直至不太活動(dòng)為止。 雌魚：輕壓腹部，卵子流出。收集到小培養(yǎng)皿中。 雄魚：同雌魚。加1ml D-hanks液稀釋。