男性不育的實(shí)驗(yàn)室診斷及評(píng)估,南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 周作民,維持男性生育的基本條件： （1）睪丸內(nèi)產(chǎn)生足夠數(shù)量的精子。 （2）精子在男性生殖管道內(nèi)獲得運(yùn)動(dòng)能力和 受精能力，既精子的成熟。 （3）輸精管道通暢。 （4）具有正常的性功能。 （5）附屬性腺功能正常。,不育癥診斷的步驟： 1. 病史采集: 包括年齡、職業(yè)、生育史、疾 病史、家族史等。 2. 體格檢查：包括外生殖器和全身體檢。 3. 實(shí)驗(yàn)室診斷 4. 特殊檢查,一、 精液常規(guī)分析 精子（5%） 精液組成 精囊腺液（60%）凝固因子、果糖 精漿（95%）前列腺液（20%）液化因子 尿道球腺液（3%） 睪丸液、附睪液 精子,精液分段成分： 前段睪丸液，附睪液（精子），尿 道球腺液 中段前列腺液 后段精囊腺液,精液變量的參考值： 精液量：26ml 顏色：灰白 液化時(shí)間：60% 活力： A+B50%或A25% 精子計(jì)數(shù)：2000萬(wàn)/ml 畸形率：30% 膿細(xì)胞： 5個(gè)/HP （1106/ml),精子活力分級(jí) A 級(jí)：快速前向運(yùn)動(dòng) B 級(jí)：慢或呆滯的前向運(yùn)動(dòng) C 級(jí)：非前向運(yùn)動(dòng) D 級(jí)：不動(dòng),影響精液常規(guī)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的因素： 自身的波動(dòng)性: 要求首次檢查應(yīng)連續(xù)進(jìn)行兩次,間隔時(shí)間7 天3周，兩次結(jié)果差異大時(shí)應(yīng)再檢一次。,每周測(cè)定一次精子密度，連續(xù)120周，期間此人未服藥，也無(wú)發(fā)熱，結(jié)果顯示精子密度可有顯著性波動(dòng)。, 禁欲時(shí)間： 要求2天 采精方式： 要求用手淫法或取精器取精。 盛精容器： 要求用對(duì)精子無(wú)毒性的玻璃或塑料容器。 室溫： 要求不低于20度 觀察時(shí)間： 要求精液液化后，取精后1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。 檢測(cè)設(shè)備： 冬天檢測(cè)應(yīng)注意保溫。,精液常規(guī)異常的分析： 1. 精液量異常 1) 無(wú)精液癥：精液量6ml 病因：附屬性腺感染 附屬性腺功能亢進(jìn),2. 精液液化及粘稠度異常 精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流動(dòng)性大。 病因：精囊腺炎癥 精液不液化或液化不全：液化時(shí)間30分 病因：前列腺功能障礙,3. 精液pH異常： 測(cè)量方法：pH試紙(pH范圍6.1-10.0 或6.4-8.0) pH過(guò)低：pH7.2 原因：輸精管和精囊腺的缺如 附睪病變 pH過(guò)高： 原因：精囊腺液分泌過(guò)多 前列腺液分泌過(guò)少,4. 精子記數(shù)異常： 正常20106個(gè)/ml 測(cè)定方法：血球計(jì)數(shù)板 一次性精子計(jì)數(shù)板 Makler精子計(jì)數(shù)板 CASA儀 1) 少精子癥：250106個(gè)/ml,5. 精子畸形： 觀察方法：吉姆薩染色法或瑞士染色法 巴氏染色法 布賴(lài)恩利什曼染色 肖爾染色法 畸形分類(lèi)：頭部畸形：大頭，小頭，錐形頭，梨形頭， 無(wú)定形頭，空泡樣頭，雙頭等。 頸和中段畸形：缺尾，彎曲尾，腫脹，過(guò)薄等。 尾部畸形：短尾，多尾，斷尾，卷尾，雙尾等 胞質(zhì)殘余體：常位于精子頸部,白細(xì)胞檢查： 正甲苯胺藍(lán)過(guò)氧化酶染色法： 結(jié)果：白細(xì)胞染成棕紅色 聯(lián)苯胺法：染料：聯(lián)苯胺玫瑰紅 結(jié)果：白細(xì)胞褐色；其它細(xì)胞品紅色。,二精子運(yùn)動(dòng)特性的檢測(cè)和分析 1. 顯微鏡觀察： 注意事項(xiàng)： (1)取精液10 ul，滴于玻片，蓋上2222蓋玻片，靜置1 分鐘后觀察。 (2) 控制溫度，最好在37進(jìn)行 (3) 每次觀察46個(gè)視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算A級(jí)、 B級(jí)、C級(jí)和D級(jí)精子的百分比，連續(xù)觀察兩張滴片， 誤差不得10%。,2. 多點(diǎn)曝光技術(shù)：在1秒鐘內(nèi)對(duì)精子連續(xù)曝光6次，可判斷精子的運(yùn)動(dòng)速度及運(yùn)動(dòng)軌跡。 精子運(yùn)動(dòng)速度分布： 快速： 25微米/秒 中速： 1025微米/秒 慢速：10 微米/秒,3. 計(jì)算機(jī)輔助的精子分析系統(tǒng)（CASA） 原理：用高分辨率攝像機(jī)實(shí)時(shí)記錄精子及精子運(yùn)動(dòng)圖象， 用分析軟件對(duì)圖象進(jìn)行處理和分析，并得出結(jié)果。 硬件：顯微鏡，攝像機(jī)，微機(jī) 軟件：圖象分析系統(tǒng),2019/8/23,29,可編輯,參數(shù)及意義： 1) 運(yùn)動(dòng)精子密度：活動(dòng)率 前向運(yùn)動(dòng)率 2) 活力參數(shù)：平均路徑速度 曲線(xiàn)速度 直線(xiàn)速度,不足之處： 價(jià)格高 誤判多：特別是脫落細(xì)胞多時(shí) 不能識(shí)別畸形精子、膿細(xì)胞 對(duì)待檢標(biāo)本的精子密度有一定要求：精子數(shù)量少時(shí)， 計(jì)數(shù)偏高，精子數(shù)量高時(shí)，活率偏高。,宮頸粘液穿透試驗(yàn)： 1) 體內(nèi)試驗(yàn)：性交后試驗(yàn)（PCT） 注意事項(xiàng)：排卵期進(jìn)行 禁欲至少2天 最好在性交后924小時(shí)進(jìn)行觀察。 診斷標(biāo)準(zhǔn)：正常為宮頸粘液中的活動(dòng)精子數(shù)50個(gè)/HP或 A級(jí)精子20個(gè)HP,影響因素：女方的內(nèi)分泌狀況。 宮頸粘液中的白細(xì)胞。 陰道pH，8.5可導(dǎo)致PCT異常。 宮頸結(jié)構(gòu)異常。 抗精子抗體影響。 性功能異常,如陰道痙攣。 精子質(zhì)量差。,2) 體外試驗(yàn)： 玻片試驗(yàn) 精子宮頸粘液接觸試驗(yàn) 毛細(xì)管試驗(yàn): 穿透介質(zhì): 人宮頸粘液; 宮頸粘液代用品: 牛宮頸粘液; 含人血清精子營(yíng)養(yǎng)液; 含牛血清白蛋白精子營(yíng)養(yǎng)液; 鮮雞蛋清;,精子頂體酶測(cè)定（明膠膜法）： 1) 制備5%明膠溶液，吸取100ul均勻涂于載玻片上，自然干燥，4濕盒備用，使用前用甲醛酒精固定液固定60分鐘。 2) 精子處理：取液化精液，用PBS稀釋至24106個(gè)/ml。 3) 涂片：取1滴精液涂于明膠膜上，37濕盒2小時(shí)。 4) 觀察：于相差顯微鏡下計(jì)數(shù)有反應(yīng)精子的百分率及精子的平均反應(yīng)直徑。 5) 正常值：平均反應(yīng)率65%，平均反應(yīng)直徑25m。,6去透明帶倉(cāng)鼠卵穿透試驗(yàn) 1) 精子準(zhǔn)備： 精液充分液化 調(diào)整精子濃度至10106個(gè)/ml 精子獲能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空氣中， 37孵育1824小時(shí)，調(diào)整精子濃度至4106/ml。,2) 卵細(xì)胞準(zhǔn)備： 取動(dòng)情第一天倉(cāng)鼠，腹腔內(nèi)注射PMSG 3040U，4872 小時(shí)后再次注射HCG 3040U，18小時(shí)后輸卵管內(nèi)取卵。 1%透明質(zhì)酸去除卵丘細(xì)胞，0.1%胰蛋白酶去除透明帶。 3) 體外受精： 將0.1ml精液加至液體石蠟下，再加入2030個(gè)倉(cāng)鼠卵，培養(yǎng)3小時(shí)。 4) 結(jié)果觀察： 相差鏡下見(jiàn)卵丘細(xì)胞內(nèi)膨大的精子頭為受精卵，計(jì)算受精率，正常為10%。,三精液生化指標(biāo)檢測(cè) 1. 酸性磷酸酶測(cè)定（ACP） 原理：P硝基酚磷酸二鈉 ACP P硝基酚 測(cè)定產(chǎn)生的P硝基酚含量，推測(cè)ACP的活性 正常值：200U一次射精 意義：反映前列腺功能,2. 果糖測(cè)定：間苯二酚法 原理：果糖間苯二酚 加熱 紅色化合物 測(cè)定化合物含量 正常值：0.873.95g/L 意義：反映精囊腺功能與精子供能有關(guān) 3. 糖苷酶測(cè)定 原理：麥芽糖 糖苷酶 葡萄糖 測(cè)定葡萄糖含量 正常值：35.187.7U/ml 意義：反映附睪功能,四抗精子抗體測(cè)定 1. 常用方法： 1) 凝集試驗(yàn)： 原理：大分子或多價(jià)抗體如IgM或分泌型IgA可以在精子間形成交鏈，產(chǎn)生精子凝集，觀察。 試管玻片凝集試驗(yàn)（FramRlin-Dukes）： 將待檢樣本與液化的精液混合后，于孵育小時(shí)，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)條以上精子頭頭、尾尾或頭尾連接即為凝集，觀察個(gè)視野，個(gè)以上出現(xiàn)凝集即為陽(yáng)性。 圓盤(pán)凝集試驗(yàn)（Friberg） 凝膠凝集試驗(yàn)（Kibrick） 缺點(diǎn)：假陽(yáng)性高,2) 精子制動(dòng)試驗(yàn)（Isojima）： 原理：在補(bǔ)體參與下，精子表面的抗精子抗體可抑制精子的運(yùn)動(dòng)能力。 缺點(diǎn)：敏感性差，IgA的作用常測(cè)不出，吸附于精子頭部的AsAb作用也常常測(cè)不出。,3) 直接免疫熒光試驗(yàn)： 原理：用熒光素標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體與精子混合后，如精子表面有抗體，則標(biāo)記的二抗吸附于精子表面，出現(xiàn)熒光。 優(yōu)缺點(diǎn)：方法敏感，假陰性少，且可確定吸附部位，但假陽(yáng)性多。 4) 免疫珠試驗(yàn)： 原理：將聚丙烯珠與兔抗人免疫球蛋白相連，如精子表面有抗精子抗體，則免疫珠與精子表面吸附，光鏡下即可觀察到，計(jì)數(shù)吸附在免疫珠上的活動(dòng)精子數(shù)，計(jì)算百分比，且可確定吸附部位。 優(yōu)缺點(diǎn)：結(jié)果可靠，且可進(jìn)行抗體分類(lèi)和定位，但價(jià)格較貴。,5）混合抗球蛋白抗體試驗(yàn)（MAR試驗(yàn)）： 原理：將精液與包被了IgG或IgA的乳膠顆?；蚣t細(xì)胞混合，在加入二抗，顆粒與活動(dòng)精子間形成混合凝集預(yù)示精子表面存在IgG或IgA.,6) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）： 原理：將精子抗原吸附于酶標(biāo)板上，加入待檢樣本，如有AsAb則吸附于精子抗原上，加入酶標(biāo)二抗，與AsAb結(jié)合，最后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 優(yōu)缺點(diǎn)：可大規(guī)模使用，但有假陽(yáng)性和假陰性，必須設(shè)定陽(yáng)、陰性對(duì)照。,五激素測(cè)定 六遺傳檢測(cè) （一）染色體檢查 染色體的非整倍體 ）性染色體的非整倍體 精子發(fā)生需要性染色體的平衡，即一個(gè)X和一個(gè)Y，X或Y的數(shù)目異常均可導(dǎo)致精子發(fā)生異常。,(1) 47,XXY男性（Klinefelters syndrome），發(fā)生率1：500，睪丸發(fā)育不良，精子發(fā)生障礙；46,XY/47,XXY亦經(jīng)常發(fā)生，伴有無(wú)精子或少精子。 (2) 48,XXXY，49,XXXXY表型為女性，陰莖發(fā)育不良，隱睪。 (3) 46,XX男性：由于Y染色體的短臂（Yp11）異位到X染色體的短臂上（Xp22）。內(nèi)生殖器表現(xiàn)型取決于Yp11的斷裂部位，Yp11遠(yuǎn)端（SRY附近）的斷裂常導(dǎo)致隱睪、小陰莖、尿道下裂。 (4) 45,X男性，較少見(jiàn)，為Y長(zhǎng)臂缺失，短臂異位至常染色體上（13,15,22常見(jiàn)）。 (5) 47,XYY發(fā)生率1：750，活檢顯示曲精小管受損，生精阻滯于精母細(xì)胞階段，有時(shí)有精子生成。少數(shù)人能生育，但胚胎易死亡，或后代有異常染色體，4575%精母細(xì)胞帶有二個(gè)Y。 (6) YA平衡異位：Y長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端的異染區(qū)（Yq12）轉(zhuǎn)移至端著絲粒常染色體的長(zhǎng)臂上，Y長(zhǎng)臂斷裂在Yq11上，斷裂部位對(duì)精子發(fā)生的影響較大，距Yq11較近時(shí)，精子發(fā)生基因受損，致精子發(fā)生障礙。斷裂距Yq11較遠(yuǎn)時(shí)，精子發(fā)生可正常并能生育，但帶有YA異位的很易再斷裂而引起不育，或?qū)愇粋鹘o子代，使子代發(fā)生斷裂而導(dǎo)致精子生成障礙。,2) 常染色體的非整倍體 在不育男子中，常染色體結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生率是有生育能力男子的10倍。 (1) 男性Turner氏綜合征（Noonan 綜合癥）： 為常染色體顯性或隱性遺傳病，染色體核型常為46, XY，或XO/XY嵌合體。 臨床表現(xiàn)：身體矮小，頸蹼，典型的臉部特征，心臟缺陷，隱睪，無(wú)精子或少精子癥，血睪酮下降，F(xiàn)SH和LH升高。 21三體（Down 綜合癥）：可生育或不育，多余的一條21可影響聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成，也可影響性染色體上性泡（Sex vesicle）的形成。 、3、9、10染色體長(zhǎng)臂的部分三體或單體可引起性翻轉(zhuǎn)，性腺退化，生精障礙。 羅伯遜異位：無(wú)精子癥患者可見(jiàn)，但常引起嚴(yán)重少精子癥。,體細(xì)胞和生精細(xì)胞內(nèi)的染色體異常可能不一致。已發(fā)現(xiàn)1號(hào)染色體的非整倍體和XY精子的發(fā)生率是體細(xì)胞的10倍，如用XY精子行ICSI則可產(chǎn)生47,XXY的后代。已有報(bào)道，ICSI的胚胎性染色體非整倍體的發(fā)生率高于自然生殖。因此對(duì)行ICSI的患者，最好進(jìn)行精子的染色體分析或植入前胚胎的遺傳分析。,（二）精子發(fā)生基因（Azoospermia factor, AZF）檢測(cè) 1. AZF存在部位：Yq11.23 2. AZF的重要候選成分：YRRM1, DYS240, DAZ 3. AZF與精子發(fā)生的關(guān)系： 精子發(fā)生障礙患者中（無(wú)精子或精子計(jì)數(shù)小于500萬(wàn)ml）約有有AZF缺失,4. AZF的檢測(cè)方法： (1) 染色體原位雜交法 (2) Southern Blot方法 (3) PCR方法：具有迅速、靈敏、操