,第七章,基因診斷與基因治療,第 一 節(jié) 基 因 診 斷 Genetic Diagnosis,基因診斷,基因,蛋白質(zhì),性狀,生化診斷,基因診斷,臨床診斷,特點 針對性強 特異性強 靈敏度高 適應(yīng)性強,一、基因診斷特點,定義 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。,基因診斷過程：,關(guān)鍵要素： 探針DNA、目的DNA、信號檢測,基因診斷過程： 制備基因探針 提取目的基因，獲得單鏈DNA PCR擴增DNA 目的DNA與尼龍膜結(jié)合 探針與目的DNA互補配對 沖洗尼龍膜 檢測雜合分子,基因診斷常用技術(shù)方法,核酸分子雜交技術(shù) 限制性內(nèi)切酶譜分析法(restriction fragment length polymorphism, RLFP) 等位基因特異寡核苷酸探針(allele specific oligonucleotide, ASO) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) SSCP（PCR-SSCP） 生物芯片 基因測序,RLFP分析法,舉例： 鐮刀狀紅細胞貧血 珠蛋白基因的第六個密碼子AT 表達產(chǎn)物：谷氨酸纈氨酸 一個堿基突變?nèi)笔?個Mst內(nèi)切酶位點 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb,Mst酶切位點(GCTNAGG),5,3,正?；?突變基因,1.15kb,1.35kb,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突變攜帶者,患者,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,甲型血友病的基因診斷（連鎖分析1）,5,3,引物1,引物2,99 bp,43 bp,Bcl I,因子VIII 基因142 bp 片段,甲型血友病的基因診斷（連鎖分析2）,142 bp 99 bp 43 bp,異常帶,先證者,胎兒,點突變（C to T）,5,3,3,5,G,探針1,探針2,A,等位基因特異寡核苷酸探針（ASO）,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。,正常人,純合突變,雜合突變,Leber 病患者 PCR/SSCP分析,+,DNA鏈末端合成終止法,基因測序,（四）基因芯片,閱讀課本，思考： 基因芯片與基因診斷有什么關(guān)系？ 基因芯片有什么優(yōu)點？ 基因芯片有哪些應(yīng)用？,基因芯片技術(shù),三、基因診斷的應(yīng)用,遺傳疾病 腫瘤 感染性疾病，傳染性流行病 判斷個體疾病易感性 器官移植組織配型 法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定,腫瘤基因診斷的策略,檢測腫瘤相關(guān)基因 癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因 檢測腫瘤相關(guān)病毒的基因 鼻咽癌EB，宮頸癌HPV 檢測腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA 肝癌甲胎蛋白（AFP） 結(jié)腸癌癌胚抗原（CEA）,腫瘤相關(guān)基因的檢測,ras癌基因的檢測 ras基因中最常見的點突變是第12，13或61密碼子突變 檢測方法： PCR/ASO PCR-SSCP, p53的檢測 p53基因突變主要為點突變，熱點區(qū)域位于密碼子130290 檢測方法： PCRSSCP PCR測序 PCRRFLP,第 二 節(jié) 基 因 治 療 Gene Therapy,基因修正(gene correction)：定點導(dǎo)入外源正?；?，代替有缺陷的基因，對靶細胞基因組無任何改變。屬于直接治療。(外源基因干擾、抑制有害基因的表達),基因治療(gene therapy)：運用DNA重組技術(shù)設(shè)法修復(fù)患者細胞中有缺陷的基因，使細胞恢復(fù)正常功能而達到治療遺傳病的目的。,基因添加(gene augmentation)：非定點導(dǎo)入外源正常基因，而沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。屬于間接治療。,如腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥、膀胱纖維癥和家族性血膽脂醇過多癥（血清膽固醇高）；血友病等遺傳病；惡性黑素瘤、神經(jīng)細胞瘤、白血病、腎癌、卵巢癌和腦癌等癌癥；以及肝功能衰竭和艾滋病等。,幾種常見的基因失活技術(shù),反義核酸技術(shù) 核酶技術(shù) 三鏈技術(shù) 干擾RNA技術(shù),基因治療的其他方法：如“自殺基因”的應(yīng)用，基因疫苗等,靶細胞（基因治療的對象）：,體細胞 & 性細胞 （美國政府1985年規(guī)定，目前治療僅限于體細胞）,2019/9/1,28,可編輯, 體細胞基因治療：使患者癥狀消失或得到緩解，但有害基因仍能傳給后代。, 生殖細胞基因治療：可根治遺傳病，使有害基因不再在人群中散布。, 已克隆正?；颍颐鞔_該基因表達與調(diào)控機制,條件： 疾病的發(fā)病機制及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能清楚, 導(dǎo)入基因具有合適的受體細胞，并能有效表達, 具有安全有效的轉(zhuǎn)運載體和方法,基因治療的關(guān)鍵/條件,關(guān)鍵： 外源基因的安全導(dǎo)入； 外源基因高效正確的表達。,基因治療的步驟：,1正?；虻闹苽洌?即分離、提取外源基因（目的基因） 2、靶細胞的選擇 3、外源基因（目的基因）的轉(zhuǎn)移 4、表達的檢測 5、回收到患者體內(nèi)。,1. 物理方法,目的基因的轉(zhuǎn)移,基因治療的步驟, 直接注射法,1. 物理方法,（一）、目的基因的轉(zhuǎn)移, 直接注射法, 電穿孔法, 微粒子轟擊法,1. 物理方法,（一）、目的基因的轉(zhuǎn)移,2. 化學(xué)法：,3. 膜融合法,1. 物理方法,（一）、目的基因的轉(zhuǎn)移,2. 化學(xué)法,3. 膜融合法,4. 受體載體轉(zhuǎn)移法:重組質(zhì)粒+特異性多肽內(nèi)吞,5. 同源重組法(homologous recombination),Bst I,同源重組法,將外源性目的基因定位導(dǎo)入受體細胞的染色體上，通過與該座位的同源序列重組交換，使外源DNA取代原位點上有缺陷的基因，達到基因修正的目的。,1. 物理方法,（一）、目的基因的轉(zhuǎn)移,第四節(jié) 基因治療,2. 化學(xué)法,3. 膜融合法,4. 受體載體轉(zhuǎn)移法,5. 同源重組法(homologous recombination),6. 病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(virus mediated gene transfer) 以病毒為載體，將外源性目的基因通過基因重組技術(shù)，組裝到病毒載體上，并使重組病毒感染受體宿主細胞，完成基因轉(zhuǎn)移。,反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組。小鼠白血病病毒 DNA病毒介導(dǎo)載體：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等。,近幾年臨床的基因治療實例：,復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療 黑色素瘤的基因治療 血友病 其它遺傳病的基因治療其它遺傳病諸如白種人中常見的囊性纖維化的進展很快。,腺苷酸脫氨酶(ADA)缺乏癥是AR致死性疾病，患者由于ADA缺乏，脫氨腺苷酸增多，改變甲基化能力，產(chǎn)生毒性效應(yīng)，使T淋巴細胞受損，導(dǎo)致嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷癥，引起反復(fù)感染，以致死亡。,1. ADA缺乏癥,基因治療的臨床應(yīng)用,1990年，Anderson小組 1% -25%,1. ADA缺乏癥,基因治療的臨床應(yīng)用,患者的缺陷基因是否被被切除？,1991年復(fù)旦大學(xué)首次進行乙型血友病的基因治療，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移因子的cDNA到體外培養(yǎng)的患者皮膚成纖維細胞中，再回植入患者皮下。 患者體內(nèi)可檢測因子的基因表達產(chǎn)物，濃度約為正常人的 5 。,2、乙型血友病,3、癌癥的治療,抑制癌細胞增生基因 導(dǎo)入癌細胞 抑制癌細胞轉(zhuǎn)錄 DNA片斷導(dǎo)入癌細胞 提高機體免疫力基因?qū)朊庖呦到y(tǒng),阻斷癌細胞繁殖,提高免疫力,例：細胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療,IL-2 Gene TNF-Gene （白介2） （腫瘤壞死因子） 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 導(dǎo)入 TIL（體外培養(yǎng)的自體細胞） 回植患者體內(nèi) TIL進入自體腫瘤部位，提高細胞因子殺傷腫瘤細胞 的作用。,如： 自殺基因 + 病毒載體 轉(zhuǎn)染 重組載體,藥物前體 無毒 Gene酶 藥物復(fù)合物 有毒,細胞死亡,例如： 單純皰疹病毒 哺乳動物細胞 HSV Gene-TK （在腫瘤細胞中表達，正常細胞中不表達） GeneTK GCV（胸苷類似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脫氧胸苷酸 腫瘤細胞死亡 鄰近細胞死亡/凋亡（旁觀者效應(yīng)）,基因治療的應(yīng)用與展望,應(yīng)用,展望,遺傳性疾病、心血管疾病、腫瘤、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病,進一步尋找切實有效的基因 精密調(diào)控外源基因在人體內(nèi)的表達 體細胞移植和重建的生物學(xué)研究 減少外源基因?qū)C體的不利影響,基因治療有待解決的問題 1、難以獲得真正有治療作用的基因。 2、外源基因的表達難以在體內(nèi)精確調(diào)控。 3、體細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)特性會有 改變。 4、過多的外源蛋白對機體帶來可能的影響。 5、隨機整合潛在的威脅。,1999年9月，Arizona的Jesse Gelsinger因患鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(OTC)部分缺乏癥在Pennsylvania大學(xué)接受基因治療，4天后出現(xiàn)發(fā)熱、凝血而死亡，成為死于基因治療實驗的第一個病人。,1. 導(dǎo)入基因的持續(xù)表達,基因治療中存在的問題及解決方法,2. 導(dǎo)入基因的高效表達 3. 安全性問題-2002年法國,基因治療存在問題與倫理學(xué),1導(dǎo)入基因的穩(wěn)定/高效表達外源基因轉(zhuǎn)移入病人體內(nèi)細胞表達。 2導(dǎo)入基因的安全性基因治療的安全性應(yīng)確保。不因?qū)胪庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異。,3試圖糾正生殖細胞遺傳缺陷或通過遺傳工程手段來改變正常人的遺傳特征則是引起爭議的領(lǐng)域(倫理）,1999年9月，Arizona的Jesse Gelsinger因患鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(OTC)部分缺乏癥在Pennsylvania大學(xué)接受基因治療，4天后出現(xiàn)發(fā)熱、凝血而死亡，成為死于基因治療實驗的第一個病人。,基因診斷與基因治療（課堂練習(xí)） 1. 核酸分子雜交主要內(nèi)容有 制備核酸樣本 B. 制備與標(biāo)記特異探針 C. 核酸樣本的分離、變性、轉(zhuǎn)移和固定 預(yù)雜交、雜交和漂洗 E. 檢測雜交信號 下列是常用核酸雜交方法的用途，錯誤的是 Southern 印跡雜交法可用于檢測特異RNA序列片斷 Southern 印跡雜交法可用于檢測特異DNA序列片斷 Northern印跡雜交法可用于檢測DNA或RNA Northern印跡雜