阻斷孤啡肽受體對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用王高翔劉文博孫緒德姚立農(nóng)柴偉摘要目的研究側(cè)腦室給予孤啡肽受體阻斷劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法雄性SD大鼠55只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、對(duì)照組(C組)和三個(gè)不同劑量的給藥組（T0.03、T0.3、T3）。對(duì)照組和給藥組都采用線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈模型（MCAO），缺血2h后恢復(fù)再灌注。給藥組分別于手術(shù)前45min右側(cè)腦室給予孤啡肽受體阻斷劑Nphe0.03nmol、0.3nmol、3nmol,體積10ul。S組和C組于手術(shù)前相同時(shí)間點(diǎn)側(cè)腦室給予相同體積的生理鹽水，其中S組給予與C組相同的手術(shù)操作但不置于尼龍線。每組大鼠隨機(jī)分為兩部分，其中8只在恢復(fù)再灌后24h行行為學(xué)評(píng)分,后斷頭取腦行TTC染色，計(jì)算腦梗死容積。3只在恢復(fù)再灌后24小時(shí)斷頭分離右側(cè)海馬組織，WesternBlot法分析caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果與C組相比,T0.3和T3給藥組的行為評(píng)分明顯提高，T3組有顯著性差異（P0.05）。T0.3、T3給藥組的腦梗死容積明顯減小，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。WesternBlot分析結(jié)果顯示T0.3、T3組在缺血再灌后24小時(shí)caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論阻斷孤啡肽受體能劑量依賴性減輕腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與阻斷神經(jīng)元凋亡有關(guān)。關(guān)鍵詞孤啡肽；孤啡肽受體；腦缺血再灌注；caspase-3TheprotectionoforphaninreceptorantagonistNphe1onfocalcerebralischemiainratsWanggao-xiang,1Liuwen-bo2,Sunxu-de1,Yaoli-long1,Chaiwei11,DepartmentofAnesthesia,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Tangduhospital.7100382,DepartmentofNurosurgey,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xijinghospital710032Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofintracerebroventricularadministrationofORL-1antaonistoncerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.MethodsFifty-fivemaleSDratsweredividedrandomlyinto5groups:shamoperatedgroup(Sgroup)；controlgroup(Cgroup)；treatment0.03nmolgroup(T0.03)；treatment0.3nmolgroup(T0.3)andtreatment3nmolgroup(T3).Theanimalsincontrolgroupandtreatmentgroupswereexposedtothesuturemiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)modelandthereperfusionafter2hoursocclusion.TheanimalsintreatmentgroupswereintracerebroventricularlygivenORL-1antagonist(Nphe)45minutesbeforeMCAOsurgery,respectively.TheanimalsinShamandControlgroupsweregiventhesamevolumeofnormalsalineatthesamepoint，ShamandControlgroupsweregiventhesamesetofsurgicaloperation,butnot作者單位：710038西安市，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科（王高翔、孫緒德,、姚立農(nóng)、柴偉）；第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)外科（劉文博）責(zé)任作者柴偉修改placedinnylonline.Alltheanimalsineachgroupwererandomlydividedintotwoparts:eightofthemforbehavioralscoreandTTCstainingat24hoursafterMCAOsurgery；threeofthemfordetectingcaspase-3levelinrighthippocampusbyWestern-blotat24hoursafterMCAOsurgery.ResultsComparedwiththecontrolgroup,thebehaviorscoresinT0.3andT3groupsweremarkedlyincreasedwithhigherinT3group(P0.05).ThevolumeofcerebralinfarctioninT0.3andT3groupsweresignificantlydecreaseddose-dependently(P0.05).Western-blotanalysisrevealedthatadministrationof0.3nmoland3nmolNphe1significantlydecreasedthecaspase-3proteinexpressioninhippocampusaftercerebralischemia-reperfusion.ConclusionORL-1antagonistcanattenuatetheinjuryofcerebralischemia-reperfusiondose-dependently,anditsmechanismmaybeassociatedwithdecreasedneuronapoptosis.Keywords:orphanin；orphaninreceptor；cerebralischemia-reperfusion；caspase-3孤啡肽受體（opioidrecetor-like1receptor,ORL-1）是1995年1、2發(fā)現(xiàn)的一種新的阿片肽受體，參與機(jī)體許多生理功能及行為的調(diào)節(jié)，包括學(xué)習(xí)記憶、痛覺(jué)、嗅覺(jué)等多種感覺(jué)信號(hào)的整和以及運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，缺血后孤啡肽水平明顯升高，并影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及缺血后腦血流3、4。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了ORL-1的拮抗劑對(duì)腦缺血損傷后大鼠行為學(xué)變化和腦梗死容積的影響，并初步探討其機(jī)制。材料和方法動(dòng)物和試劑健康雄性4月齡SD大鼠55只，體重280-320g，隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組（S組）、對(duì)照組(C組)和三個(gè)不同劑量的給藥組（T0.03、T0.3、T.3），每組11只。術(shù)前7天購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于20-25的室溫環(huán)境中。自由進(jìn)食、飲水。孤啡肽受體阻斷劑（Nphe1NC（1-13）NH2，Nphe1，Sigma公司），利用生理鹽水溶解，配成終濃度分別為0.03nmol/10ul、0.3nmol/10ul和3nmol/10ul，置于2-4冰箱保存待用。側(cè)腦室給藥大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水。1戊巴比妥鈉（50mg/Kg）麻醉后，水平固定于立體定向儀上。于Bregma點(diǎn)后0.8mm，矢狀縫右側(cè)1.5mm.用牙齒小鉆定點(diǎn)上鉆孔，微量進(jìn)樣器進(jìn)針深度3.8mm。緩慢勻速推注藥物，時(shí)間為10ul/10min，留針2min后退出進(jìn)樣器，縫合皮膚。局灶性缺血模型（MCAO）的制作側(cè)注射完成后，根據(jù)Koizumi5等的方法，暴露右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉下方剪一切口，將一尼龍線（3-0,EthiconInc,Japan）置于頸內(nèi)動(dòng)脈1718mm，阻閉大腦中動(dòng)脈，縫合皮膚。120min后抽出尼龍線，恢復(fù)再灌注。術(shù)中動(dòng)物體溫維持在37-37.5。行為學(xué)評(píng)分動(dòng)物完全蘇醒后，將動(dòng)物放回鼠籠，自由飲食。再灌注24h后由不了解分組情況的觀察者根據(jù)Garcia6評(píng)分法評(píng)估并記錄神經(jīng)功能障礙評(píng)分（NDS）。該評(píng)分法最低為3分，最高為18分，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能。37分為重度神經(jīng)功能障礙，811分為中度神經(jīng)功能障礙，1218分為輕度神經(jīng)功能障礙。腦梗死容積的計(jì)算和測(cè)量行為學(xué)評(píng)分完成后，斷頭處死動(dòng)物，迅速取出鼠腦，置于冰鹽水中10min，取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，放入20g/l的2，3，5-氯化三苯四唑（TTC，）溶液（37）中染色10min，然后用40g/l甲醛緩沖液固定。24h后用數(shù)碼相機(jī)拍照，用圖像處理軟件（ADOBEPHOTOSHOP7.0）計(jì)算梗死面積（粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū)）。為校正腦水腫帶來(lái)梗死容積的偏差，用占對(duì)側(cè)正常容積的百分比表示梗死容積。梗死容積=（對(duì)側(cè)正常組織容積同側(cè)正常組織容積）/對(duì)側(cè)正常組織容積100%。Westernblot檢測(cè)Caspase3的表達(dá)再灌注24h后，戊巴比妥鈉麻醉隨機(jī)抽取的3只大鼠立即處死取出全腦，在預(yù)冷至4的生理鹽水中取出右側(cè)海馬組織，加入txl裂解液100ul,于冰盒中迅速、充分勻漿，12000g離心15min，收集上清液，100煮沸變性后上樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳(30g泳道)。電泳結(jié)束后，按程序進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗處理并進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，壓片曝光后進(jìn)行圖像處理分析。統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，采用單因素方差分析（ANOVO），多組間兩兩比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）檢驗(yàn)。神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分采用非參（Kruskal-Wallis）檢驗(yàn)，若存在組間差異，以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)Bonferroni進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果缺血再灌注后24h神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1）：S組動(dòng)物的NDS評(píng)分正常。C組和T0.03組大鼠NDS評(píng)分顯著下降，二者之間未見(jiàn)明顯差異，提示小劑量的孤啡肽受體阻斷劑并不能減輕大鼠缺血再灌后神經(jīng)元的損傷。T0.3組大鼠的NDS評(píng)分有所提高，但與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T3組大鼠的NDS評(píng)分較C組有明顯的提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。腦梗死容積的測(cè)量顯示（見(jiàn)圖2）：S組未見(jiàn)梗死，C組和T0.03組梗死面積明顯高于T0.3組和T3組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。說(shuō)明0.3nmol和3nmol的孤啡肽受體阻斷劑能夠減輕缺血再灌注后的神經(jīng)元損傷，其中3nmol組的效果更為明顯（p0.05）。Western-blot結(jié)果顯示（圖3）：C組大鼠海馬組織Caspase3表達(dá)較Sham組顯著升高，腦缺血再灌注24后給藥之各組大鼠Caspase3表達(dá)與C組比較均顯著受到抑制，但仍明顯高于S組，這于NDS評(píng)分和腦梗死容積測(cè)量的結(jié)果比較一致。討論孤啡肽受體（ORL-1）屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族7。古航等8研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)缺血缺氧新生鼠下丘腦及外周血中孤啡肽（orphanin-FQ，OFQ）含量均顯著升高，如果缺血合并缺氧則會(huì)使OFQ的上升程度更高，恢復(fù)時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)9，Tekes.K等的研究認(rèn)為體內(nèi)OFQ水平升高可能假手術(shù)組和對(duì)照組做些什么動(dòng)作與5-羥色胺能神經(jīng)功能失調(diào)有關(guān)10。缺血后OFQ的升高對(duì)機(jī)體的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。我們認(rèn)為：腦缺血及缺血/再灌（I/R）所引起的OFQ升高會(huì)大量激活其內(nèi)源性配基-ORL1受體，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體促發(fā)一系列的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致顱內(nèi)環(huán)境的急劇改變，可能會(huì)進(jìn)一步加劇缺血后的神經(jīng)元損傷。因此，我們假定給予ORL-1的拮抗劑將對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用，減輕缺血后神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。Nphe1NC（1-13）NH2（簡(jiǎn)稱Nphe1）是以能激活ORL-1最小片段NC（1-13）-NH2為模板，設(shè)計(jì)的孤啡肽受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能明顯的降低孤啡肽與其受體的親和力，并且與其它阿片受體不發(fā)生交叉反應(yīng)11，是目前研究孤啡肽和其受體的常用藥物。我們?cè)谀X缺血之前45分鐘通過(guò)腦室內(nèi)給予不同劑量的Nphe1,發(fā)現(xiàn)給予0.3nmol和3nmol的Nphe1能顯著提高腦缺血再灌注后大鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，并明顯減小腦梗死容積,并且呈劑量依賴性。以上結(jié)果表明阻斷ORL-1能夠減輕腦缺血后的神經(jīng)元損傷。Caspase（半胱氨酸需要的天冬氨酸蛋白酶）是一個(gè)蛋白酶家族，媒介細(xì)胞死亡，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的“最后通道”；其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程的重要下游分子，可以造成許多關(guān)鍵蛋白的裂解，因而被認(rèn)為是一種效應(yīng)Caspase12。其表達(dá)量的多少可以作為細(xì)胞凋亡程度的指標(biāo)。所以我們利用western-blot檢測(cè)大鼠腦缺血后24h時(shí)caspase-3在缺血側(cè)海馬的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定劑量的孤啡肽受體阻斷劑能降低缺血側(cè)海馬Caspase-3蛋白的表達(dá)。此結(jié)果提示，ORL-1在腦缺血損傷中的作用可能是通過(guò)其下游的效應(yīng)分子或蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重缺血后的腦神經(jīng)元損傷。腦缺血/再灌注損傷是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，作用機(jī)制復(fù)雜。同時(shí)孤啡肽受體的作用也涉及機(jī)體的多個(gè)方面。我們的實(shí)驗(yàn)只是為研究孤啡肽受體在腦缺血作用作一個(gè)初步的研究，有待進(jìn)一步深入。參考文獻(xiàn)：1MeunierJC,MollereauC,TollL.etal.Isolationandstructureoftheendogenousagonistofopioidreceptor-likeORL1receptor.Nature.1995,377:532-535.2ReinxcheidRK,NothackerHP,BoursonA,etal.OrphaninFQ:aneuropetidethatactivatesanopioidlikeGprotein-coupledreceptor.Science1995,270:792-794.3NelsonRM,CaloG,GuerriniR,HainsworthAH,GreenAR.LambertDG.Nociceptin/orphaninFQinhibitsischaemia-inducedglutamatNeeffluxfromratcerebrocorticalslice.Neuroreport.2000Nov,27:11(17)3689-92.4ArmsteadWM.Relationshipbetweennociceptin/orphaninFQandcerebralhemodynamicsafterhypoxia-ischemiainpiglets.AmJPhysiolCircPhysiol,2000,278：477-483.5KoizumiT,YoshidaYandNakazawaT,Experimentalstudiesofischemicbranedema:anewexperimentalmodelofcerebralembolisminratsinwhichrecirculationcanbeintroducedintheischemicarea.JpnJStroke.1986,8:1-8.6GarciaJH,WagnerS,LiuKFandHuXJ.Neurologicaldeficitandextentofneuronalnecrosisattributabletomiddlecerebralarteryocclusioninrats.StatsticalValidation.Stroke1995,26:627-634.7薛慶生.孤啡肽和其受體的研究進(jìn)展J國(guó)外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)復(fù)蘇分冊(cè),2002,（04）:236-238.8古航，胡電，洪新如，等.缺血缺氧新生鼠下丘腦及外周血孤啡肽含量的變化及意義J.中華婦產(chǎn)科雜志,2003,38(11):683-684.9ArmsteadWM.NOC/OFQcontributestohypoxic-