第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 一 蛋白質(zhì)的分子量 二 兩性游離和等電點(diǎn) 三 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng) 五 蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 一 蛋白質(zhì)的分子量 蛋白質(zhì)的分子量一般在1萬(wàn) 100萬(wàn)道爾頓由于是生物大分子 因此在溶液中極不穩(wěn)定 不能用測(cè)定小分子物質(zhì)的方法 如冰點(diǎn)降低 沸點(diǎn)升高 來(lái)測(cè)定一般以滲透壓法 凝膠過(guò)濾 聚丙烯酰胺凝膠電泳及超離心法來(lái)測(cè)定其分子量 超離心法較準(zhǔn)確 但實(shí)驗(yàn)條件要求很高 二 兩性游離和等電點(diǎn)1 pH pI4 7 pH pI7 7 pH pI9 7 由于蛋白質(zhì)是由氨基酸組成 氨基酸所具有的兩性游離性質(zhì) 蛋白質(zhì)也同樣具有 二 兩性游離和等電點(diǎn)2 肽與氨基酸都有 COOH NH2 但肽還含有側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán) 且其為主要解離基團(tuán) 肽鏈中的 COOH與 NH2相距較遠(yuǎn) 因此它們之間的靜電引力較弱 可離子化程度較低 大的肽比小肽的離子化程度低 即大肽完全質(zhì)子化所需pH比小肽低 N端 NH2的pK 值比游離氨基酸的小 C 端的 COOH的pK 值比游離氨基酸的大 側(cè)鏈R基的pK 值在兩者之間 蛋白質(zhì)兩性游離的特點(diǎn) 二 兩性游離和等電點(diǎn)3 在同一pH溶液中 由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量以及分子大小不同 因此它們?cè)陔妶?chǎng)中的移動(dòng)速度也有差別 可以利用這種性質(zhì)來(lái)分離和分析蛋白質(zhì) 稱為蛋白質(zhì)電泳分析法 常用的有紙上電泳 醋酸纖維膜電泳 聚丙烯纖維的凝膠電泳 蛋白質(zhì)兩性游離的應(yīng)用1 二 兩性游離和等電點(diǎn)3 蛋白質(zhì)兩性游離的應(yīng)用2 電泳 三 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1 由于蛋白質(zhì)分子大 且球狀蛋白質(zhì)分子中親水的氨基酸殘基多位于顆粒表面 故在水溶液中能與水起水合作用 因此 蛋白質(zhì)的水溶液具有親水膠體的性質(zhì) 為什么蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì) 三 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2 蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有二個(gè)穩(wěn)定因素 即顆粒表面的水化層和電荷 若無(wú)外力條件作用 不致互相凝集 如除掉這兩個(gè)穩(wěn)定因素 蛋白質(zhì)便容易凝集析出 因此 可用此原理提取蛋白質(zhì) 如常用中性鹽硫酸胺來(lái)競(jìng)爭(zhēng)水而使水化膜破裂 產(chǎn)生沉淀 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的原因 三 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)3 蛋白質(zhì)具有許多高分子溶液的性質(zhì) 如擴(kuò)散 粘度大 不能透過(guò)半透膜 利用不能透過(guò)半透膜的性質(zhì)可以將蛋白質(zhì)和其他一些小分子分開(kāi) 常用方法有滲析和超濾 三 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4 滲析 血液透析 小分子被帶出 透析機(jī) 透析液 血液 加壓 三 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4 超濾 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1 概述 定義 使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象 原理 蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素有水化層和帶電層 水化層是蛋白質(zhì)分子表面的許多親水基團(tuán)與水分子結(jié)合形成的一層水膜 它使蛋白質(zhì)顆粒不能相互接觸聚集成大顆粒 帶電層是蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)在一定pH環(huán)境下解離產(chǎn)生的 由于帶同性電荷的蛋白質(zhì)顆粒相互排斥 也使蛋白質(zhì)顆粒不能聚集 當(dāng)改變這些穩(wěn)定因素 蛋白質(zhì)分子相聚集而從溶液中析出 特點(diǎn) 一般沉淀出的蛋白質(zhì)是變性的 如果控制實(shí)驗(yàn)條件 如低溫 溫和沉淀劑 便可得到不變性的蛋白質(zhì) 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2 方式1 定義 加入大量中性鹽 硫酸胺 以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)從水溶液沉淀析出 鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 溶解度最小 易沉淀 則效果最好 各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小 親水程度不同 故鹽析所需的鹽濃度也不一樣 因此 調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)的溶液中的中性鹽的濃度 可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀 1 鹽析1 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2 方式1 1 鹽析2 蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域 聚集了許多水分子 鹽濃度高時(shí) 它們被鹽抽出 暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合 沉淀 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2 方式2 pH稍大于等電點(diǎn)為宜 因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)帶負(fù)電 易與金屬離子結(jié)合成鹽 通常這種沉淀為變性的 如控制溫度 低溫 并控制重金屬離子濃度 則可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì) 2 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2 方式3 某些生物堿試劑 如苦味酸 鎢酸 鞣酸 碘化鉀等 及某些酸 三氯乙酸 水楊磺酸 硝酸等 與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀 沉淀?xiàng)l件應(yīng)當(dāng)是pH小于等于電點(diǎn) 這樣蛋白質(zhì)帶正電 易與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽 3 生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質(zhì) 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2 方式4 可與水混合的有機(jī)溶劑 如酒精 甲醇 丙酮等能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀 如酒精的消毒作用 在低溫條件下 變性進(jìn)行較緩慢 可以用來(lái)制備蛋白質(zhì) 其優(yōu)點(diǎn)在于 不像鹽析那樣存在有大量鹽類 必須經(jīng)透析除去 而且有機(jī)溶劑很易通過(guò)稀釋透析及蒸發(fā)等方法除去 4 有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì) 四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2 方式5 將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉下 雞蛋煮熟后 本來(lái)流動(dòng)的蛋清 蛋黃都變成固體樣的東西了 這是蛋白質(zhì)凝固作用應(yīng)用于食品加工的典型例子 5 加熱凝固 五 蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性 變性1 定義 以某些物理或化學(xué)因素的作用 使蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間構(gòu)象破壞 不包括肽鍵的斷裂 而引起蛋白質(zhì)若干理化和生物學(xué)性質(zhì)的改變 影響蛋白質(zhì)變性的因素 紫外線照射 加熱煮沸 強(qiáng)酸 強(qiáng)堿 重金屬鹽和有機(jī)溶劑處理等 原理 維持蛋白質(zhì)二級(jí) 三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的嚴(yán)格構(gòu)象的力只是一些弱的次級(jí)鍵 它們很容易被破壞 特點(diǎn) 天然構(gòu)象被破壞 蛋白質(zhì)失去了生物學(xué)活性 五 蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性 變性2 五 蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性 變性3 五 蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性 復(fù)性 復(fù)性 某些變性蛋白質(zhì) 再除去變性因素后 可以重新獲得其天然結(jié)構(gòu)和生物活性 稱為蛋白質(zhì)的 復(fù)性 如有一些球蛋白被熱或極端pH變性后 若緩慢冷卻或緩慢恢復(fù)到正常pH時(shí) 將重新獲得其天然結(jié)構(gòu)和生物活性 這種復(fù)性現(xiàn)象 即蛋白質(zhì)折疊研究中的所謂 折疊 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1 1 雙縮脲反應(yīng)1 原理 蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵 因此也能起雙縮脲反應(yīng) 形成紅紫色混合物 應(yīng)用 可以用此反應(yīng)來(lái)定性測(cè)定蛋白質(zhì) 也可在540nm處比色 定量測(cè)定蛋白質(zhì) 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1 2H2N C NH2 H2N C N C NH2 NH3 1320C O O H O 尿素 雙縮脲 雙縮脲 CuSO4 NaOH 紫紅色物質(zhì) 1 雙縮脲反應(yīng)2 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)2 2 酚試劑 福林試劑 反應(yīng) 原理 蛋白質(zhì)分子一般都含有酪氨酸 而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物 鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物 應(yīng)用 常用此反應(yīng)來(lái)定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量 最近普遍使用的Brodford法 考馬思亮蘭G 250法 將會(huì)在以后的實(shí)驗(yàn)接觸 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)3 含有芳香族氨基酸 特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)所特有的呈色反應(yīng) 蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后先產(chǎn)生白色沉淀 加鹽則白色沉淀變成黃色 再加堿呈橙黃色 因?yàn)橄跛釋⒌鞍踪|(zhì)分子中的苯環(huán)硝化 產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物 3 蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)1 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)3 3 蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)2 硝基酚 黃色 鄰硝醌酸鈉 橙黃色 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)4 4 米倫化反應(yīng) 米倫試劑為硝酸汞 亞硝酸汞 硝酸和亞硝酸的混合液 當(dāng)?shù)鞍兹芤褐屑尤朊讉愒噭┖蠹串a(chǎn)生白色沉淀 加熱后沉淀變成紅色 由于酚類化合物有此反應(yīng) 酪氨酸含有酚基 故有此反應(yīng) 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 5 乙醛酸反應(yīng)1 在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸 并沿試管壁慢慢注入濃硫酸 在兩液層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán) 凡含有吲哚基的化合物都有此反應(yīng) 由于色氨酸含有類似結(jié)構(gòu) 因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng) 六