I 摘 要 棉鈴蟲 世界性重要農業(yè)害蟲。 蟲晶體蛋白（ 其對靶標昆蟲的高度特異性和對人畜無害，使其相關基因成為目前應用廣泛的基因。 隨著轉 因棉花種植面積的快速增長， 轉入的抗蟲基因在棉花體內持續(xù)表達，使得棉鈴蟲在整個生長周期都受到 蟲蛋白的高壓選擇，存在產生抗性的風險，因此，棉鈴蟲的抗性問題不容忽視。通過對棉鈴蟲對 生抗性的機制的研究，可以為棉鈴蟲的抗性治理提供 理論指導，并為棉鈴蟲的防治提供新的思路。 本論文利 用 法分別擴增 了 對 素敏感 （ 96和 對其具有 抗性 ( 棉鈴蟲 五齡幼蟲 的中腸氨肽酶 , 因的去信號肽片斷 ，比較了它們的堿基和氨基酸的差異，并成功地將其在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)里進行表達。主要結果如下： 基因克隆與 測定 結果，鑒定認為棉鈴蟲 氨肽酶 N (因家族的 1 個成員 ， 其列具有 2982 個核苷酸 ， 編碼產生 993 個氨基酸的蛋白質。其 C 端有一段 25 個氨基酸組成的片段具 有親脂性和跨膜特性。 利用 件比對 96 系的序列得知：抗性品系有 3 個堿基缺失，即 36失， 16 個堿基發(fā)生突變，即 579A T， 803C T， 854G A， 1250C T， 1460T C，1486A T， 1497C T， 1647G C， 2135T C， 2231G A， 2586T C， 2597A T， 2615A G，2703G C， 2831G T， 2859A C，導致 1 個氨基酸缺失，即第 45 位的蘇氨酸缺失， 5 個氨基酸發(fā)生突變，即 194 蘇氨酸絲氨酸， 550 纈氨酸 異亮氨酸 ， 861 異亮氨酸蘇氨酸， 902 丙氨酸脯氨酸， 954 蘇氨酸脯氨酸。其中 194 蘇氨酸絲氨酸位于與 素 合的活性區(qū)，與棉鈴蟲對 性存在潛在的密切關系。 861 異亮氨酸蘇氨酸，蘇氨酸殘基提供潛在的新磷酸化位點，用于翻譯后修飾，此位點突變會破壞它鄰近的半胱氨酸殘基形成二硫鍵能力，打破受體的三級結構，可能導致抗性產生。 將 隆入 達系統(tǒng)中桿狀病毒轉移載體 多角體基因啟動子的下游，篩選出重組質粒 轉化大腸 桿菌 體內進行重組，經抗性和藍白斑篩選，獲得桿狀病毒重組載體 染粉紋夜蛾（ 胞（ 獲得含 因的重組桿狀病毒，重組病毒感染 胞后，得到表達的蛋白。析和點雜交顯示，目的基因得到了表達。 這些結果將為分離、純化受體蛋白，探索受體蛋白與 素的相互作用提供基礎，為進一步研究抗性機制奠定基礎。 關鍵詞 棉鈴蟲，氨肽酶 N（ ），受體，桿狀病毒表達系統(tǒng)，表達 is of to no to so to As t in H. of is So . t be on of . t t In 1 (in . t (96CR 6-S in . in as PN of ,982 93 5 6-S . A in 79th , 803CT, 854GA, 1250CT, 1460TC, 1486AT, 1497CT, 1647GC, 2135TC, 2231GA, 2586TC, 2597AT, 2615AG, 2703GC, 2831GT, 2859AC, in 36194 550 861 902 954 5In in 94th . is a 61 of of in It B e+, of of of to t to on . t. , 錄 第一章 文獻綜述 . 1 言 . 1 t 的殺蟲機理 . 2 體蛋白的種類及作用 . 4 結構特征及作用 . 6 鈴蟲體內 分布、與 結合模型及與抗性的關系 . 9 表達及功能研究 . 11 狀病毒載體表達系統(tǒng) . 11 論文研究的目的與意義 . 13 第二章 研究內容和技術路 線 .究內容 . 14 究技術路線 . 14 第三章 因的克隆及序列分析 .料與試劑 . 21 驗方法 . 17 提取 . 17 轉錄 . 17 增 . 17 物的回收純化 . 18 接 . 19 化 . 19 粒 提取 . 20 測 . 20 列測定 . 21 果與分析 . 21 信號肽序列的克隆 . 21 信號肽序列及序列分析 . 23 同抗性水平 信號肽序列及序列分析 . 24 論 . 26 第四章 表達及鑒定 .料與試劑 . 27 驗方法 . 29 酶切重組和供體質粒 . 29 收 . 30 連接 . 30 化 . 30 粒 提取 . 31 酶切鑒定 . 31 制作 . 31 . 32 單 菌落 . 32 取基因組 . 32 定 . 32 轉染 . 33 白鑒定 . 33 白鑒定 蛋白的純化 . 34 果與分析 . 34 組轉移載體 構建及鑒定 . 34 組桿狀病毒的鑒定 . 36 組桿狀病毒轉染 胞 . 36 因在昆蟲 胞中的表達 . 37 論 . 37 第 五 章 全文結論 .考文獻 . 40 致謝 .者簡歷 .V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 芐青霉素 氨肽酶 N 狀緣膜囊 43狀病毒表達系統(tǒng) 血清蛋白 云金芽孢桿菌 化 乙 錠 大霉素 基 磷脂 酰肌醇 丙基 代半乳糖苷 那霉素 kb 堿基對 道爾頓 化硝基四氮唑 OD 光度 酸鹽緩沖液 合酶鏈式反應 丙烯酰胺凝膠電泳 環(huán)素 XD溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 文獻綜述 言 蘇云金芽孢桿菌 (目前全世界產量最大、使用最廣的生物殺蟲 劑。它的主要活性成分是一種或數種殺蟲晶體蛋白 (又稱內毒素（ (黃大昉 ,2001)。 敏感昆蟲有強烈的毒性，而對高等動物和人無毒?，F在 翅目和鞘翅目的昆蟲，此外，研究還發(fā)現 膜翅目、同翅目、食毛目的多種害蟲及植物病原、線蟲、螨類和原生動物也有控制作用（ et 1998）。 由于 生的殺蟲晶體蛋白對昆蟲具有專一、高效和對人畜安全等優(yōu)點，使其相關基 因成為目前應用廣泛的抗蟲基因。自 1987 年，比利時和美國的科研人員分別將 因轉入煙草和番茄以來，先后獲得了棉花、玉米、馬鈴薯、煙草、水稻、番茄等 40 多種能夠高劑量表達 轉基因植物，我國也先后將 因轉入了煙草、甘藍、棉花、玉米和水稻等作物 (黃大昉， 2001)。轉 因棉花在我國于 1997 年 開始 商業(yè)化 種植 ，到 2005 年種植面積 已達到 330 萬公頃 ，占棉花總播種面積的 66%（ 2006） 。 棉鈴蟲 屬于鱗翅目，夜蛾科，實 夜蛾亞科，棉鈴蟲屬，是世界性重要農業(yè)害蟲。主要分布在北緯 50 度至南緯 50 度的亞洲、大洋洲、非洲及歐洲各地，它也是我國棉區(qū)的重要害蟲之一。它具有寄主范圍廣、繁殖潛能大、種群能遠距離遷移和對環(huán)境適應能力強等特點，條件適宜時常大面積暴發(fā)成災，造成棉花、玉米、花生、豆類、蔬菜、花卉的嚴重損失，其中以棉花遭受的損失最大。 20 世紀 90 年代以來，我國北方棉區(qū)連續(xù)幾年大暴發(fā)，僅1992 年因棉鈴蟲危害，我國棉花平均減產 30%左右，直接經濟損失達 100 億元，嚴重制約了棉花的生產 (郭予元， 1998)。究其原因，除自然條件適宜、繁 殖能力強等因素外，棉鈴蟲對化學農藥的高抗性，特別是對擬除蟲菊酯的高抗性是棉鈴蟲暴發(fā)的一個重要原因。由于抗藥性的迅速上升，導致了棉花的嚴重減產，很大程度上挫傷了棉農植棉的積極性，種植面積銳減，使國民經濟遭受了巨大的損失。同時，由于化學殺蟲劑的大量施用，給環(huán)境帶來了負面影響，破壞了自然界的生態(tài)平衡，給人類的身心健康帶來了威脅，嚴重阻礙了農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 轉 因抗蟲棉的殺蟲活性高、有效持續(xù)時間長并且對整個植株都有保護作用，可顯著降低農藥的用量，且與其它防護措施的兼容性好，作為棉花害蟲綜合防治技術體系的基礎設 施，具有很高的經濟價值 (張少燕， 2002)，在國內外已經得到廣泛的應用。 但是由于轉入的抗蟲基因在棉花體內持續(xù)表達，使得棉鈴蟲在整個生長周期都受到 蟲蛋白的高壓選擇，存在產生抗性的危險。一旦棉鈴蟲對 基因棉花產生抗性，不僅會威脅各種 劑、轉 因棉花和其他轉物的使用壽命，而且會導致殺蟲劑的大量使用，對環(huán)境造成負面影響。自 1985 年 物制劑產生抗性以來，國內外已發(fā)現 10 余種昆蟲對 以產生抗性。 1990 年， 田間發(fā)現小菜蛾 劑產生抗性 。2001 年在澳洲新南威爾士（ 昆士蘭州（ 田間抗性監(jiān) 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 測中發(fā)現棉鈴蟲能夠在 素的選擇下存活下來。 2004 年， 道粉紋夜蛾溫室對 劑產生抗性 。 室內篩選實驗表明，多種昆蟲 可以對 蟲劑和轉因棉花產生高度的 抗性，包括印度谷螟 (et 1994)， 干果斑螟 鈴薯甲蟲 et 2002） ， 北美楊葉甲 紋夜蛾，甜菜夜蛾 芽夜蛾 et 995），歐洲玉米螟 倦庫蚊 棉鈴蟲 (梁革梅， 2000； et 2003)等。 許多學者曾從生物化學、分子 生物學、組織病理學等方面研究了 素的作用機制（ et 1998;et 003），及昆蟲中腸環(huán)境對 性的影響等 （ et 1990; 邵宗澤 ,2001， 2002） 。 毒素殺蟲作用的高度特異性暗示了在昆蟲的中腸上皮 刷狀緣 膜細胞 （ 上有特異的結合受體?；钚远舅嘏c昆蟲腸體上的受體發(fā)生不可逆結合后，如何最終使細胞膜穿孔以及孔的特征，現在還是不很清楚，可謂是眾說紛紜，有待于進一步的研究。但 比較公認的一點是：與受體結合后活性毒素的部分結構在受體的幫助下插入昆蟲中腸上皮細胞的細胞膜而非直接作用于細胞器，并導致穿孔，也就是說 殺蟲作用與昆蟲腸體上的受體蛋白有著密不可分的關系 （ et 2005）。 t 毒素 的殺蟲機理 盡管已經發(fā)現的 素有 100 多種，但是僅有幾種被證明有防效，如 過 X 射線衍射分析， 三級結構已被分析，發(fā)現被激活后它們的 結構在總體上非常相似。它們都是由三個典型結構域 (成，即結構域，結構域，結構域。估計所有的 有與 類似的三級結構（ Li et 1991,1996; et 2001; et 2001）。結構域位于肽鏈的 N 端，由 7 個兩性疏水的螺旋組成，是毒蛋白的毒性區(qū)域，其主要功能可能插入細胞膜內形成孔洞，其中 4 和 5可能是參與了孔洞的形成（ et 999; et 2001）。結構域位于肽 鏈的中間，是一個高度可變區(qū)，結構為三個反向平行的折疊，并形成三個裸露的環(huán)象結構，主要功能是決定毒素與不同昆蟲受體特異性結合。結構域由二個反向平行的折疊形成包囊著 C 端的夾層結構組成，也是一個高度可變區(qū)，主要作用是毒素蛋白的殺蟲專一性 (et 2000)，凝集素狀結構識別受體分子的 (et 999;et 2000)，參與離子通道傳導，并保護活化的活性多肽 N 端不被蛋白酶進一步降解 (Li et 1991)。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 圖 構圖（ 1991,1996） . 991, 1996） 素 被昆蟲取食后，在昆蟲體內 堿性 （ et 2005）、 專一性 蛋白酶（ et 2006） 的作用下，原毒素被分解成具有殺蟲毒性的毒蛋白，后者和昆蟲中腸上的毒素受體蛋白結合， 引起毒素構象的改變， 使得腸壁破損，形成孔洞，使得中腸的堿性內含物進 入血腔，血淋巴 升高，從而導致感病幼蟲麻痹而死亡。而有些研究表明： 蛋白影響鉀離子通道的運輸，而不影響鈉離子通道的運輸。因此， 蛋白引起細胞膜在特異的位置 (離子通道 )上形成小孔，使離子通道失去作用，打破離子運輸的平衡，從而引起細胞溶解而導致昆蟲幼蟲死亡 (et 2006)。值得指出的是，不同的 蛋白可能會影響不同的離子通道 (et 2006)，其細胞膜上具親和性的受體也很可能就是離子通道上的某種組分。 素殺蟲機制的另一種可能性是 蛋白與位于細 胞膜上的受體結合，引起受體構象的改變，使該運輸系統(tǒng)出現異常，喪失了運輸能力，甚至將細胞內的物質逆運而出，等效于細胞膜成孔，從而造成昆蟲死亡 (et 1998)。 目前， 素蛋白插入完整細胞膜形成孔洞的機理還不清楚。毒素與膜的結合及毒素插入細胞膜前后的電生理變化等實驗證實， 素結構域的螺旋結構中的短的多肽參與了孔洞的形成，這與預測的結果相符。 素作用后，昆蟲中腸細胞膜兩側形成了強的勢能，并且這種勢能可能與孔洞的形成有關。 2001 年， 用多層薄片狀脂質體 和雙層平面脂質體膜模擬毒素與中腸細胞膜的結合試驗，結果顯示， 素的溶解是毒素和脂質體共同作用的結果，而多種 素的進一步作用是受體調節(jié)的結果。所以，推測 通過在膜上形成離子通道或孔洞起作用的。但是，毒素和細胞膜相互作用的分子機理還沒有研究清楚。 昆蟲體內細胞膜上 素造成孔洞的結構目前還不清楚，但是，人工合成膜體外模擬試驗顯示，毒素與膜結合后，毒素蛋白構象發(fā)生變化，即螺旋結構富集的結構域與結構域、分離，中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 包括 4 和 5 螺旋的發(fā)卡結構隨后插入細胞膜，形成孔洞 (et 2001)。 體蛋白的種類及作用 雖然 蛋白抗性機制目前有不同看法，但受體蛋白及其與抗性的關系一直是大家研究的熱點。已有許多學者對許多昆蟲的 素受體蛋白進行了研究。 目前文獻報道的 素受體蛋白主要包括以下幾類：氨肽酶 N(鈣粘蛋白 (族、堿性磷脂酶 (肌動蛋白 (糖脂 ( 肽酶 N (次在煙草天蛾 1994)中被發(fā)現為 結合蛋白，其分子量為 120合在 120殘基 ， 的結合位點，主要依據為： 結合受 特異性抑制，而不是其他糖類；導致 能結合的結構域的突變，將檢測不到 120et 2001)。隨后多種昆蟲的 分離和鑒定，且不同的昆蟲 數量可能不一樣。 120 為 受體蛋白已在 煙芽夜蛾 (et 1995)、舞毒蛾 et 1995）、小菜蛾、粉紋夜蛾 (et 1994)中被發(fā)現和鑒定（ et 995, et 996;et 995;et 997）。梁革梅（ 2005）利用 交證明棉鈴蟲中腸 主要受體蛋白為 120 170且 120白具有 性，是通過 定，可以利用 其從膜上解離下來。 et 2005）利用親和層析法純化棉鈴蟲中腸上 受體蛋白為 124 162 者均具有 性。 在煙芽夜蛾中除 120， 170被克隆和鑒定，還有 130 140過可能為 170降解產物（ et 995; et 997）。 2001 年 發(fā)現在煙芽夜蛾中存在與原來 同的 110 個 110蛋白質原來沒有被鑒定為一種 它與澳洲棉鈴蟲 H. 樣，含有不同的 守序列，根據澳洲棉鈴蟲的 列設計的煙芽夜蛾 增，得到與澳洲棉鈴蟲 89同源性的產物； 交表明該蛋白不能被大多凝集素識別，說明它缺失 125I 標記 突變體，該突變體改變了 結合位點，結果表明該突變體不能與120 170合，卻能與 110 合，以上試驗結果表