密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 水稻 入黃葉突變體基因克隆與功能分析 I 摘 要 葉綠體的 正常發(fā)育需要控制葉片發(fā)育及編碼葉綠體蛋白的核基因與編碼自身蛋白的葉綠體基因之間的相互協(xié)調(diào)。 這些基因的突變將導(dǎo)致葉綠體發(fā)育的缺陷、 葉綠素合成減少，葉色變異等。作為一種易于觀察的性狀突變，葉色突變體 是研究 光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控機制的理想材料 。本研究以轉(zhuǎn)綠型 水稻 入黃葉突變體 材料， 研究了 其 遺傳規(guī)律、光合特性、 突變基因及其功能， 從植物生理和分子水平上初步闡明了 變體的突變機理， 為 變體 在水稻光合生理、功能基因組學(xué)研究和生產(chǎn)等方面的利用提供了理論依據(jù)。另外，本研究還對水稻 入黃葉 突變體 在不同光照條件下的光系統(tǒng) 確了光照強度對 其 光合特性的影響 ，為探討 變體的突變機理 及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 1. 變體鑒定與遺傳分析表明， 變體為 單隱性核基因控制的 入突變體，且只有一個 入拷貝 。 其未展開葉呈乳黃色，葉片展開后葉色從葉尖向葉基部開始轉(zhuǎn)綠，但完全轉(zhuǎn)綠的葉片仍比野生型淺綠。 變體的這種表型在整個葉片生長發(fā)育期間保持穩(wěn)定不變。 正常生長和結(jié)實，是國內(nèi)外尚未報道的一種新型水稻葉色突變體。 2. ，其倒二葉葉綠素 a、葉綠素 b、 其葉綠素 a/ 隨著葉片的發(fā)育， 其 葉綠體發(fā)育較野生型顯著滯后。 2以心葉生長出的第一天為 0d)，有一個完整的內(nèi)囊體膜體系，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，基粒片層豐富，而對應(yīng) 片的葉綠體基粒垛疊減少，即使 12二葉葉綠體，基粒片層仍明顯少于 2然 I（ 最大光化學(xué)效率與野生型之間無明顯差異，但其 電子傳遞速率 (光化學(xué)猝滅系數(shù) (非光化學(xué)猝滅系數(shù) (野生型顯著減少，表明其光合系統(tǒng) 供體側(cè)和受體側(cè)的光化學(xué)活性均受到了嚴(yán)重抑制； I（ 應(yīng)中心蛋白 多的葉綠素參與其光系統(tǒng) I（ 素蛋白復(fù)合體的形成。 3. 采用 法，從 變體植株中獲得了 入位點的右翼序列，對右翼序列 進行 對及 入與表型的 共分離驗證 ，獲 得 變體候選基因 定 染色體， 在其第一個外顯子起始密碼子下游 64。根據(jù) 列設(shè)計特異引物進行 增，獲得了 長 轉(zhuǎn)基因功能互補驗證，確定 變體目的基因。 一個新的葉色突變基因，具有一含有鋅指結(jié)構(gòu)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶互作蛋白功能域 水稻中， 要存在于基因編碼產(chǎn)物分別為鋅指蛋白、逆轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄元件類似蛋白和一種假定蛋白 4 類基因中，具有翻譯后修飾的功能，在調(diào)節(jié)核基因的表達和信號傳導(dǎo) 中也具有重要作用； 因在根中表達較弱，在葉中表達較強，在莖中的表達中等；除了在 2d 未展開的倒二葉中表達稍弱外 (以心葉生長出的第一天為 0d)， 因在 d、 6d、 8d 和 12d 倒二葉中均較強表達，說明 因不存在時空表達特異性 。 采用 簽技術(shù)和基因槍轉(zhuǎn)化法將 因轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細胞，將 因定位在細胞質(zhì)中，這與 有翻譯后修飾的功能一致。 4. 變體是一個葉綠素 b 減少型的突變體， 在整個生長發(fā)育期間始終表現(xiàn)為淺黃色的葉色表型，其 葉綠體類囊體膜和基粒片層較野生型顯著減少。在微弱 的光照條件下 (50 其色素含量、 事實光化學(xué)效率 (光化學(xué)淬滅 (光下開放的反應(yīng)中心捕獲的激發(fā)能效率(顯著低于野生型， 但其 a/b 比值遠遠高于野生型 。隨著光照強度的增加， 其 總?cè)~綠素含量、 加， a/b 比值、 單位色素的光吸收強度 下降， (Z+A)/(V+A+Z)比值伴隨著非光化學(xué)淬滅 (顯著增加而顯著增加。 變體 較野生型發(fā)育遲緩與其光能利用率低有關(guān)，而與光照強度無關(guān)。 變體 主要 采用葉黃素循環(huán)淬滅多余的激發(fā)能而 免受光抑制的傷害。 關(guān)鍵詞： 稻黃葉突變體，遺傳規(guī)律，光合特性， 因，功能分析 he is in of is of of of to of so of In of so as to at of be in on In of so as to of on to in as 1. of of a by a a of to be of of of no 2. of a b of a, b, in of a b of of of of to a of by In or no 2of m) , at in to D2 I of In a of in 3. of YL on of on 4bp TG of YL a of RF ST YL by a a a in a in of In in in in a in he of of to , in d, 6d, 8d, 12d of YL In to in to FP FP by 000/ of in is in of 4. yl a b at in yl of in At 50 S2 of by S2 of hl a/b as of no in S2 m). of 100 00 a in of hl a/b v V of yl of of of yl 32nm 63nm of of yl of of of yl 00 it of Z+A)/(V+A+Z) in yl yl of No in in hl a/b yl of by a in of in yl as of 錄 第一章 文獻綜述 . 1 稻葉色突變體的產(chǎn)生方法 . 1 理、化學(xué)誘變 . 1 入突變 . 2 座子 插入突變 . 2 稻葉色突變體的類型 . 3 稻葉色突變體的遺傳規(guī)律 . 4 稻葉色突變基因的定位 . 4 稻葉色突變相關(guān)基因的克隆 . 9 色突變表型的光溫調(diào)控 . 9 稻葉色突變的分子機制 . 10 綠素合成受阻 . 10 綠體分化與發(fā)育受阻 . 13 核信號傳導(dǎo)途徑受阻 . 13 綠體蛋白轉(zhuǎn)運受阻 . 14 色突變體的應(yīng)用前景 . 15 色突變體在光形態(tài)建成 中的應(yīng)用 . 15 色突變體在植物激素生理中的應(yīng)用 . 15 色突變體在植物病理 中的應(yīng)用 . 16 色突變體在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用 . 16 為標(biāo)記性狀應(yīng)用于水稻雜交育種 . 16 色突變體在 高光效育種中的應(yīng)用 . 17 研究的目的和意義 . 17 第二章 變體的鑒定與遺傳分析 . 18 料與方法 . 18 試材料及其種植 . 18 取 . 18 草劑 理 . 18 測 . 18 . 19 果與分析 . 19 變體的 表型 . 19 變體的 鑒定 . 19 變體的遺傳分析 . 22 論 . 22 第三章 變體的光合特性研究 . 24 料與方法 . 24 試材料及其種植 . 24 片葉綠素和 . 24 射電子顯微鏡（ 析 . 24 光動力學(xué)參數(shù)測定 . 25 囊體膜色素蛋白復(fù)合體的分離與分析 . 25 果與分析 . 25 變體的葉綠素含量動態(tài)分析 . 25 變體葉綠體發(fā)育的電鏡動態(tài)分析 . 25 變體 成熟 葉的熒光動力學(xué)分析 . 25 變體類囊體膜色素蛋白復(fù)合體 析 . 28 論 . 28 第四章 變體基因克隆與功能分析 . 30 料與方法 . 30 試材料 . 30 劑 . 30 取 . 32 入位點右翼序列的擴增 . 32 粒 小量提取 . 32 脂糖凝膠 收 . 32 . 32 入位點右翼序列 生物信息學(xué)分析相關(guān) 軟件或工具 . 32 入與 變體表型共分離的 測 . 32 選基因 隆 . 32 基因植物表達載體的構(gòu)建 . 33 選 基因 功能互補驗證 . 33 的基因 織與階段表達特異性的 析 . 33 的基因 亞細胞定位 . 33 果與分析 . 33 入位點右翼序列擴增及其 生物信息學(xué)分析 . 33 入與 變體表型共分離分析 . 35 選基因 隆與序列分析 .